研究背景心血管的重构贯穿于血管内膜损伤后再狭窄、动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)、高血压等多种心血管疾病的发生、发展过程中,是各种病变维持、恶化的病理结构基础。近年来,血管外膜在损伤后血管重构过程中所起的作用得到了空前的关注。研究证明,外膜对血压升高的反应是最敏感的,并且早于血管中膜和内膜,而且外膜的这种变化是高血压血管结构改变的最早征象之一。血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts, AF)在血管损伤后发生增殖、迁移、分泌细胞外基质,是参与血管损伤后新内膜形成和血管重塑的重要内容。转化生长因子β1 (Transforming growth factorβ1, TGF-β1)是迄今为止所发现的功能最为复杂的生长因子之一,被公认为是影响AF生物功能最直接,也是最重要的细胞因子。Smad信号通路是TGF-β1的经典下游信号通路,与众多组织如心肌、肝脏、肺及肾脏等的纤维化密切相关。根据Smad在信号转导中的作用可将其分为三类：(1)受体调节型Smad(Receptor activated Smad, R-Smad),包括Smad 1、2、3、5、8,为Ⅰ型受体激酶的底物,在特定的TGF-β超家族成员的信号转导通路中发挥作用；(2)共同介质型Smad(Common Smad, Co-Samd),主要是Smad4。Smad4被磷酸化后可以与R-Smad形成杂聚体,然后进入细胞核内对靶基因的转录进行调节；(3)抑制型Smad(Inhibitory Smad, I-Smad),包括Smad6、7,可以阻断R-Smad与受体或与Co-Samd的结合,从而对Smad信号通路发挥负调控作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是新兴的生物技术,被Science评为2002年十大科学成就之首。RNA干扰是一种由目的基因所对应的小分子双链RNA (Double-stranded, dsRNA)启动的序列特异的基因沉默过程,从而导致相应的mRNA被降解,进而阻断基因的表达。人工合成的siRNA可特异性地抑制哺乳类细胞中内源性或外源性基因的表达,使相应基因保持沉默或休眠状态。SiRNA所诱发的基因抑制具有高效性和高度的序列特异性。本实验通过观察TGF-β1诱导AF生物活性的改变,并用RNA干扰的方法,研究在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中TGF-β1/Smad信号通路的作用机制,且进一步探讨Smad2和Smad3在上述过程中的不同作用。目的1.观察TGF-β1对外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成的影响。2.探讨TGF-β1/Smad信号通路在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中的作用机制,并研究Smad2和Smad3在这些过程中的不同作用。方法1.体外原代成纤维细胞的培养与鉴定：采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉成纤维细胞。大概3-7天可见细胞从组织块周围爬出；SABC法行平滑肌肌动蛋白-α(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色鉴定。取第3-8代细胞用于实验。2.小干扰RNA链的合成、有效浓度的筛选：设计并分别合成3条Smad2和Smad3特异性siRNA,同时合成荧光标记的阴性对照siRNA(FAM-siRNA)1条和Smad2/3非特异性阴性对照siRNA 1条。细胞密度达50%-70%时转染FAM-siRNA。转染后荧光显微镜观察荧光阳性细胞,计算转染效率,根据转染效率选择siRNA和Lipofectamine 2000最佳转染浓度。3.细胞转染和小干扰有效链的筛选：根据Lipofectamin 2000的转染步骤,用western-blot检测各组siRNA的干扰效率,进行有效链的筛选。4.MTT法检测细胞的增殖能力：接种细胞,按照说明进行细胞转染,24h后,加入含20 ng/ml TGF-β1的正常培养液,继续刺激24h。于刺激结束前4h每孔加入MTT,然后吸弃上清,加入DMSO,比色。5. Transwell检测细胞迁移能力：应用6孔板transwell小室行体外迁移实验。细胞分组和处理同前,处理过的细胞消化后用DMEM制成细胞悬液,取0.6 ml悬液以5×105/ml的密度接种于上室,下室中加入1.5 ml含10%FCS的正常培养基。37℃培养6h,将上室内侧附着的细胞用湿棉签擦去,固定,伊红和苏木素染色,倒置显微镜下随意取5个视野进行细胞计数(×100)。6.实时定量PCR检测相关因子mRNA的表达：细胞处理同前,采用Trizol法提取总RNA,并在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA。观察基因沉默和TGF-β1处理后,Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。采用2-ΔΔCt方法对mRNA表达进行相对定量分析。7. Western-blot检测相关因子蛋白的表达：取对数生长期细胞消化计数,转染24h后,加入TGF-β1孵育24h,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。8.统计学处理所有数据资料均采用SPSS 16.0进行统计处理。实验数据用x±s表示,组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.原代细胞的生长形态及鉴定贴壁3-7d后可见细胞从不同的组织块边缘爬出,取第3代细胞,用α-SMA和Vimentin行免疫细胞化学染色,阳性率达100%。2.针对Smad2或Smad3的siRNA片段均可以有效下调Smad2或Smad3的表达SiRNA转染并经TGF-β1刺激后,干扰组Smad2或Smad3蛋白的表达较单纯刺激组下降80%以上。且小干扰具有高度特异性和选择性,即siRNA-Smad3只降低Smad3蛋白的表达,而对Smad2蛋白的表达没有影响,同样siRNA-Smad2只作用于Smad2,而对Smad3蛋白表达没有作用。3.基因沉默Smad2或Smad3对外膜成纤维细胞增殖影响(1)与正常对照组相比,TGF-β1刺激组增殖显著增强(P<0.01); Smad2基因被干扰之后,细胞增殖较单纯TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的增殖能力。(2) Smad3基因被沉默后,细胞增殖能力较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调可以显著抑制成纤维细胞的增殖。(3) SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞的增殖,但两者差异没有统计学意义(P>0.05)。4.基因沉默Smad2或Smad3对外膜成纤维细胞迁移的影响(1)与正常对照组相比,TGF-β1刺激后细胞迁移能力显著增强(P<0.01)；下调Smad2基因表达之后,细胞迁移较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的迁移能力。(2) Smad3基因被沉默后,细胞迁移能力较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调亦可以显著抑制成纤维细胞的迁移能力。(3) SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞迁移能力,然而两者之间差别无统计学意义(P>0.05)。5.基因沉默Smad2或Smad3对TGF-β1信号转导通路相关因子mRNA表达的影响(1)经TGF-β1刺激后,Smad2、Smad3、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达均较正常组显著增强(P<0.05或P<0.01),而Smad7 mRNA表达则无显著差异(P>0.05).SiRNA介导Smad2表达下调后,与TGF-β1刺激组相比,α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01), Smad7 mRNA表达则无显著差异(P>0.05)。(2) Smad3基因被沉默后,α-SMA, I及Ⅲ型前胶原mRNA较TGF-β1刺激组减弱,其差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Smad7 mRNA表达无显著差异(P>0.05)。(3)SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达,但两者之间差别无统计学意义(P均>0.05)。6.基因沉默Smad2或Smad3对TGF-β1信号转导通路相关因子蛋白表达的影响(1)经TGF-β1刺激后,Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白表达均较正常组显著增强(P<0.01),而Smad7蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。SiRNA介导Smad2表达下调后,与TGF-β1刺激组相比,p-Smad2、α-SMA、I型前胶原蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P< 0.01),Smad7蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。(2) Smad3基因被沉默后,p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白较TGF-β1刺激组减弱,其差异具有统计学意义(P<0.01)。Smad7蛋白表达无显著差异(P>0.05)。(3)SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA,Ⅰ型前胶原蛋白表达,但两者之间差别无统计学意义(P>0.05)。结论1.实验中所选用siRNA可以高效并特异地阻断Smad2或Smad3的表达。2. TGF-β1对外膜成纤维细胞的增殖有促进作用,Smad2和Smad3信号通路共同参与其中。3. TGF-β1促进外膜成纤维细胞的迁移,这一过程需要Smad2和Smad3的共同参与。4. TGF-β1诱导成纤维细胞转分化和胶原沉积,是依赖Smad2和Smad3信号转导通路的共同作用。研究背景高血压病是严重危害人类健康的常见病和多发病,其发病率逐年升高,目前我国成人发病率高达18.8%。随着对高血压病发病机理的研究和降压药的发展,患者血压水平多能得到有效控制,但高血压所伴发的靶器官损害的发病率、致残率和致死率仍然高居不下。血管重构(Vascular remodeling, VR)既是高血压状态下机体对各种改变的适应性行为,又是高血压病持续发展恶化的重要病理学基础。研究血管重构的发生和逆转机制,对有效控制血压、预防和减轻各种并发症具有非常重要的意义。血管外膜在高血压血管重构中的作用越来越受到重视,血压升高是促使外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblast, AF)变为肌成纤维细胞(Myofibroblast, MF)的重要因素,后者具有增殖及迁移活性,可由外膜向中膜和内膜下间隙迁移,同时能够促进细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)合成,导致晚期纤维化,管腔缩窄,参与了血管重构。转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1, TGF-β1)是重要的促纤维化细胞因子之一,可以通过激活一系列的细胞内信号传导通路,引起靶基因的转录。Smad是其主要的细胞内信号转导途径,与众多组织如心肌、肺及肾脏等的纤维化密切相关。中药血清药理学方法是指给动物灌服中药一定时间后,用其血清进行实验研究的药理学研究方法。这种实验方法不仅体现了药物在生物体内的生物转化,同时克服了中药复方研究中其他因素的干扰。芩丹胶囊(Qindan capsule, QC)是导师临床治疗高血压病的经验方,有清热平肝、化瘀和络的功效。以前的研究表明该药能够改善SHR大鼠主动脉壁形态学指标,降低主动脉中膜胶原含量,改善SHR大鼠主动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型改变。但是其对血管外膜及TGF-β1/Smad信号系统的影响尚不明了。本研究探讨了芩丹胶囊对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、表型转化以及细胞外基质合成的影响,并探讨在此过程中TGF-β1/Smad信号转导通路的作用机制,以期为临床防治高血压病血管损害提供更多科学依据。目的1.观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白-α(alpha smooth muscle actin,α-SM actin)、Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白表达的改变,探讨芩丹胶囊对TGF-β1诱导的AF的生物活性的影响。2.观察芩丹胶囊含药血清对TGF-β1诱导的AF Smad2、Smad3、Smad7、磷酸化Smad2 (phosphorylation-Smad2, p-Smad2)和磷酸化Smad3 (phosphorylation-Smad3, p-Smad3) mRNA和蛋白表达的影响,探讨芩丹胶囊对外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路的作用。方法1.芩丹胶囊的制备及质量标准的研究：采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)和薄层层析法(Thin-layer chromatography, TLC),明确芩丹胶囊的有效成分。2.成纤维细胞的复苏与传代：取出冻存管,快速解冻,用正常培养基悬浮细胞,离心后转移至培养瓶。待细胞长至90%融合时进行传代。3.芩丹胶囊含药血清的制备：60只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：芩丹胶囊大剂量组(QC大剂量组)给予QC 750mg/(kg·d);芩丹胶囊小剂量组(QC小剂量组)给予QC 150mg/(kg·d);氯沙坦组给予氯沙坦30 mg/(kg-d)。各组均大鼠灌胃给药,最后一日禁食24h,末次给药后1h(氯沙坦组)和2h(芩丹胶囊组)后乙醚麻醉,腹主动脉取血,37℃水浴1 h,3000 rpm离心15min,取上清,过滤除菌,然后在-57℃条件下真空干燥,-20℃保存备用。4.MTT比色法检测细胞增殖能力：制备细胞悬液,接种于96孔板,各组加入相应血清继续孵育48h,换用含20 ng/ml TGF-β1的培养基诱导24h,在刺激结束前4h加入MTT,弃上清,加入DMSO,振荡,比色。5. Transwell法检测细胞迁移能力：细胞分组和处理同前,经过处理的细胞被消化,然后用DMEM制成细胞悬液,取0.6ml细胞悬液接种于上室,1.5ml含10%FCS的正常培养基加入下室。置入孵箱内培养6h,取出小室用湿棉签擦内侧的细胞,然后固定染色,计数。6.实时定量PCR技术检测相关因子mRNA的表达：细胞处理同前,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。观察芩丹胶囊和氯沙坦含药血清对TGF-β1诱导的Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。用2-△△Ct的方法对mRNA的表达进行相对定量分析。7. Western-blot技术检测相关因子蛋白的表达：细胞分组和处理方法同前,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。8.统计学处理所有实验数据用x±s表示,数据资料均用SPSS 16.0进行统计处理。组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,设P<0.05为有统计学差异。结果1.各实验组细胞增殖情况的比较与正常对照组相比,TGF-β1刺激组的AF增殖活性明显加强(P<0.01)；各药物处理组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P<0.05或P<0.01),其中以氯沙坦组减弱最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01),QC大剂量组和氯沙坦组较QC小剂量组有显著差异(P<0.05)。2.各实验组细胞迁移数目的比较TGF-β1刺激组的AF的迁移数目明显多于正常对照组,且差异具有统计学意义(P<0.01)；经药物处理以后,与TGF-β1刺激组相比,药物组细胞迁移数目均明显下降(P<0.05或P<0.01)。3.各实验组细胞Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达的比较(1) Smad2 mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞的Smad2 mRNA表达显著升高(P<0.01)；各药物处理组Smad2 mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P<0.05)。(2) Smad3 mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad3 mRNA表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,QC大剂量组和氯沙坦组Smad3 mRNA表达均显著下降(P均<0.05),QC小剂量组差异没有显著性(P>0.05)；与氯沙坦组相比,QC小剂量组Smad3 mRNA表达差异有显著性(P<0.05)。(3) Smad7 mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad7 mRNA表达没有明显变化(P>0.05)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7 mRNA表达均显著提高(P<0.01)；QC大剂量组、氯沙坦组与QC小剂量组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)α-SMA mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA mRNA表达显著升高(P<0.01)；各药物处理组α-SMA mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01),小剂量组与氯沙坦组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)Ⅰ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,QC大剂量组和氯沙坦组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P<0.05)；QC小剂量组与TGF-β1刺激组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。(6)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；氯沙坦组与QC小剂量组比较有显著差异(P<0.05)。4.各实验组细胞Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原、Smad7蛋白表达的比较(1) Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad2蛋白表达明显升高(P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,各药物组Smad2蛋白表达有所下降(P均<0.01)；氯沙坦组显著下降(P<0.01),且下降幅度大于QC大剂量组与QC小剂量组(P<0.05或P<0.01)。(2) p-Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad2蛋白表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P<0.01)；QC大剂量组和氯沙坦组表达低于QC小剂量组(P<0.05或P<0.01)。(3) Smad3蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad3蛋白表达明显升高(P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,氯沙坦组表达水平下降最明显(P<0.05),其次为QC大剂量组(P<0.05)。且氯沙坦组和QC小剂量组相比有显著性差异(P<0.05)。(4) p-Smad3蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad3蛋白表达表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad3蛋白表达均显著降低(P<0.01)；氯沙坦组与QC小剂量组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)α-SMA蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.01)；各药物处理组α-SMA蛋白表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；QC小剂量组和氯沙坦组比较有显著差异(P<0.01)。(6)Ⅰ型前胶原蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刘激组细胞Ⅰ型前胶原蛋白表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅰ型前胶原蛋白表达均显著下降(P<0.01)；氯沙坦组Ⅰ型前胶原白表达低于QC小剂量组(P<0.05)。(7) Smad7蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad7蛋白表达没有明显变化(P>0.05);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7蛋白表达均显著提高(P<0.01)；其中氯沙坦组升高最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)。结论1.芩丹胶囊能够通过TGF-β1/Smad信号转导通路抑制TGF-β1诱导的AF增殖和迁移。2.芩丹胶囊能够抑制TGF-β1诱导的AF表型转化,其机制与降低TGF-β1信号因子Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 mRNA和蛋白表达,并升高Smad7 mRNA和蛋白表达上调有关。3.芩丹胶囊能够抑制TGF-β1诱导的细胞外基质的合成,其机制与降低TGF-β1信号因子Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 mRNA和蛋白表达,并升高Smad7 mRNA和蛋白表达有关。研究背景高血压性血管重构是心血管事件的重要危险因素,转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1, TGF-β1),能够激活外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts, AF),使之迁移、增殖、表型转变及合成细胞外基质的能力增强,参与高血压性血管重构。槲皮素(3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone, Que),是自然界中分布最广的生物黄酮类化合物。大量研究已证实槲皮素是一种有效的降压药,同时还具有抗氧化、抗血栓、抗炎、减轻心肌肥厚等多种心血管保护作用。槲皮素是芩丹胶囊中桑寄生的有效成分,我们通过检测槲皮素对TGF-β1诱导的AFs增殖的影响,同时应用荧光实时定量RT-PCR检测Smad2、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA表达情况以及western blot检测Smad2和p-Smad2蛋白表达的改变,探讨了槲皮素逆转TGF-β1诱导的AFs生物活性的机制,为其临床防治高血压性血管重构提供科学依据。目的观察槲皮素对TGF-β1诱导的AFs增殖的影响,以及对Smad2、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原、p-Smad2 mRNA和蛋白的影响,探讨槲皮素逆转TGF-β1诱导的AFs生物活性的机制。方法1.AFs的复苏与传代：液氮罐中取出冻存管,快速解冻,悬浮细胞,离心,转移至培养瓶。待细胞长至90%融合时进行传代。2.MTT法检测细胞增殖情况：以细胞密度为2×104接种于96孔板,培养24h,换无血清培养基培养4h,使细胞同步生长,吸弃上清,各组加入(6.25μmol/L、12.5μmol/L和25μmol/L)槲皮素预处理细胞24h,换用含20ng/ml TGF-β1的培养基刺激24h,在刺激结束前4h加入MTT,弃上清,加入DMSO,振荡,比色。3.实时定量RT-PCR技术检测相关因子mRNA的表达：细胞饥饿4h后换用正常培养基,用各浓度的槲皮素预处理细胞24 h后,再给予TGF-β1刺激24h,提取总RNA,将RNA逆转录为cDNA。实时定量RT-PCR检测Smad2、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。4. Western-blot技术检测相关因子蛋白的表达：细胞分组和处理方法同前,提取蛋白并定量,western-blot检测p-Smad2和Smad2蛋白表达情况。5.统计学处理：所有实验数据用x±s表示,数据资料均用SPSS 16.0进行统计处理。组间差异采用one-way ANOVA分析和t检验,设P<0.05为有统计学意义。结果1.各实验组细胞增殖情况的比较与正常对照组相比,TGF-β1刺激组的AF的增殖活性明显加强(P<0.01)；大、中剂量组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P<0.01),其中以大剂量组减弱最为显著(P<0.01),其次为中剂量组(P<0.01),小剂量组和刺激组相比没有显著差异(P>0.05)。2.各实验组细胞Smad2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达的比较(1) Smad2 mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞的Smad2 mRNA表达显著升高(P<0.01)；大、中剂量组Smad2 mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中大剂量组下降最为显著(P<0.01),其次为中剂量组(P<0.01),小剂量组没有显著差异(P>0.05)。(2)α-SMA mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA mRNA表达显著升高(P<0.01)；大、中剂量组α-SMA mRNA表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01),小剂量组与刺激组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。(3)Ⅰ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大剂量组和中剂量组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P<0.05)；小剂量组与TGF-β1刺激组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。(4)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P<0.05)；其中大剂量组下降最为显著(P<0.05),其次为中剂量组(P<0.05),小剂量组没有显著差异(P>0.05)。3.各实验组细胞Smad2和(?)-Smad2蛋白表达的比较(1) Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad2蛋白表达明显升高(P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组显著下降(P均<0.01),小剂量组差异没有显著性(P>0.05)。(2) p-Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad2蛋白表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P<0.05或P<0.01)；小剂量组蛋白表达下降没有统计学意义(P>0.05)。结论1.槲皮素能够显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖。2.槲皮素抑制了TGF-β1诱导的成纤维细胞Smad2、p-Smad、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白的高表达。3.槲皮素能够通过TGF-β1/Smad2信号通路改善TGF-β1诱导的成纤维细胞的生物活性的改变。