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急性呼吸窘迫综合征（acute respriatary distress syndrome,ARDS）系临床上常见的一种急危重综合征,病理特征为肺泡上皮和毛细血管内皮的损伤,导致弥漫性的不均一性的肺间质及肺泡水肿,患者临床特征为难以纠正的低氧血症和进行性加重的呼吸窘迫。ARDS患病率在0.01%-0.05%,而死亡率高达40%,是一种严重威胁生命的疾病。ARDS的治疗仍主要为机械通气、严格的容量管理以及对症支持等,尚无有效控制ARDS进展的特效药物。因此,深入研究ARDS发生发展的分子机制,探索特异性的治疗靶点,对降低ARDS患者死亡率、改善预后都十分重要。ARDS发病机制异常复杂,失控的炎症反应被认为是ARDS发生的关键因素,血管内皮细胞屏障功能受损参与了 ARDS发生发展的关键环节。血管内皮细胞屏障功能受损可引起富含蛋白质的体液外流,而水肿液进入肺泡腔可激活中性粒细胞和肺泡巨噬细胞等炎症细胞,导致炎性细胞因子和炎性介质释放,引起炎症反应、氧化应激以及细胞焦亡等一系列事件,最终影响呼吸功能,危及患者生命。因此如何有效减轻血管内皮屏障功能受损,尤其是改善肺微血管内皮细胞的屏障功能,成为ARDS一直以来的研究热点。随着基因组学及分子测序技术的发展,大量研究表明长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）、微小 RNA（MicroRNA,miRNA）均参与了 ARDS 发生发展进程。LncRNA是一类通常由大于200 nt组成,不编码蛋白质或可能有有限多肽编码能力的RNA,广泛参与从基因复制、基因转录到蛋白质翻译转运等多种重要的生命活动,可调控细胞增殖与凋亡、炎症反应、氧化应激等诸多生物学过程。miRNA是一类由约21-25个碱基组成的非编码RNA,通过与特定靶mRNA结合参与基因转录后水平的调控。调控miRNA的表达是LncRNA的主要作用机制之一,其可通过“海绵”吸附结合miRNA的某些特定序列,使得miRNA减少与靶mRNA的结合,从而调控下游基因的表达水平。LncRNA OIP5-AS1（opa-interacting protein 5 antisense RNA 1）,由编码OIP5的基因从反义方向转录而来,其同源基因广泛存在于哺乳动物中,已被报道在多种细胞中有促进炎症反应和细胞凋亡的作用,如上皮细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞等,参与如动脉粥样硬化、糖尿病肾病、髋关节炎、脑血管疾病等多种疾病的发生发展。但LncRNA OIP5-AS1在ARDS中是否参与调控目前尚无报道。多种miRNAs被发现在急性肺损伤中出现表达异常。在急性肺损伤中,miR-223的表达受抑或缺失可加重肺部炎症损伤程度,miR-223通过抑制肺泡巨噬细胞和上皮细胞的NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,抑制促炎因子IL-1 β和IL-18的表达,可以明显减轻急性肺损伤的炎症反应。但miR-223是否能抑制NLRP3介导的肺微血管内皮细胞炎性小体通路尚无研究。生物信息学研究发现,LncRNA OIP5-AS1可以靶向结合miR-223,因此我们推测LncRNA OIP5-AS1可通过靶向miR-223来调控炎症相关蛋白的表达,参与氧化应激、炎症反应、细胞焦亡等生物学过程,在ARDS发生发展过程中起到重要作用;进一步的抑制LncRNA OIP5-AS1并靶向作用于miR-223 则可减轻或缓解 ARDS 进展。为验证这一科学假说,本研究首先在临床样本中明确LncRNA OIP5-AS1、miR-223在ARDS患者中的表达情况及两者相关性,进而利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理的人肺微血管内皮细胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells,HPMECs）研究 LncRNA OIP5-AS1、miR-223在细胞中的作用机制,最后,通过大鼠ARDS模型初步探索抑制LncRNA OIP5-AS1、过表达miR-223在ARDS中的治疗作用。第一部分LncRNA OIP5-AS1和miR-223在ARDS患者中的表达目的:对比LncRNA OIP5-AS1和miR-223在ARDS患者和健康对照者中表达的差异,并探讨LncRNA OIP5-AS1和miR-223表达之间的相关性。方法:收集2019年1月-2019年12月入住安徽医科大学第一附属医院重症监护室的20例ARDS患者,在同期体检人群中招募20例年龄、性别匹配的健康对照者。通过定量PCR检测两组LncRNA OIP5-AS1和miR-223的表达水平,并进行两者相关性分析结果:1.与健康对照组相比,ARDS患者外周血中LncRNA OIP5-AS1表达水平明显上升,miR-223表达水平明显下降2.相关性分析显示,LncRNA OIP5-AS1表达与miR-223表达呈显著负相关小结:ARDS患者中LncRNA OIP5-AS1表达水平明显上升,miR-223表达水平明显下降,两者呈显著负相关,提示LncRNA OIP5-AS1和miR-223参与ARDS的发生发展。第二部分 LncRNA OIP5-AS1通过靶向miR-223/NLRP3在LPS致HPMECs损伤中的作用机制研究目的:通过 si-OIP5-AS1 和 miR-223 mimics/inhibitor 转染 HPMECs,探讨LncRNA OIP5-AS1和miR-223在LPS致HPMECs损伤中对细胞增殖、细胞凋亡、细胞焦亡、炎症反应、氧化应激反应的调控作用。方法:1.定量 PCR 检测 LncRNA OIP5-AS1、miR-223 在 LPS 处理的 HPMECs 中的转录水平;2.在HPMECs中敲减LncRNA OIP5-AS1、过表达miR-223,MTT法和流式细胞术分析LPS处理后HPMECs细胞增殖、凋亡情况,NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1、Caspase-3、Bax 和 Bcl-2 的表达水平用蛋白免疫印迹（western blot,WB）方法检测,ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-18和IL-10表达水平,ROS、SOD和MDA产物用相应试剂盒检测;3.双荧光素酶活性测定明确LncRNA OIP5-AS1 与 miR-223、miR-223 与 NLRP3 之间的靶向关系。结果:1.LPS处理的HPMECs中LncRNA OIP5-AS1水平增加,miR-223水平下降,与ARDS患者中变化一致;2.在HPMECs中敲减LncRNA OIP5-AS1,引起细胞增殖,而LPS处理引起的细胞焦亡、炎症反应和氧化应激反应受到抑制,表现为NLRP3炎性小体表达减少,促炎因子IL-1 β、IL-6和IL-18表达减少,抗炎因子IL-10表达增加,ROS和MDA水平降低,SOD水平升高;3.miR-223是LncRNA OIP5-AS1的作用靶点,抑制miR-223可引起细胞凋亡,部分消除敲减LncRNA OIP5-AS1对HPMECs的作用,而过表达miR-223则促进了细胞增殖、抑制细胞焦亡、炎症反应、氧化应激反应,与敲减LncRNA OIP5-AS1表型一致;4.NLRP3是miR-223的作用靶点,过表达NLRP3可消除miR-223过表达对HPMECs的作用;小结:LPS处理HPMECs,可引起LncRNA OIP5-AS1表达增加,miR-223表达减少,抑制LncRNA OIP5-AS1或过表达miR-223均可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡、细胞焦亡,减轻炎症反应和氧化应激反应;LncRNA OIP5-AS1与miR-223、miR-223与NLRP3之间存在靶向关系,LncRNA OIP5-AS1通过吸附miR-223激活NLRP3信号通路参与LPS致HPMECs损伤第三部分 LncRNA OIP5-AS1和miR-223在大鼠ARDS中的治疗作用研究目的:通过腺病毒载体敲减LncRNA OIP5-AS1和过表达miR-223,探讨LncRNA OIP5-AS1和miR-223在LPS诱导ARDS大鼠中的治疗作用。方法:1.建立LPS诱导的大鼠ARDS模型,利用腺病毒载体分别携带siRNA和miR-223的目的基因,降低LncRNA OIP5-AS1表达水平、过表达miR-223;2.NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1、Caspase-3、Bax 和 Bcl-2 的表达水平用蛋白免疫印迹（western blot,WB）方法检测,ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-18和IL-10表达水平,ROS、SOD和MDA产物用相应试剂盒检测。结果:1.在LPS诱导的大鼠ARDS模型中,成功实现敲减LncRNA OIP5-AS1和过表达miR-223;2.敲减LncRNA OIP5-AS1和过表达miR-223均可减轻LPS诱导的大鼠肺组织损伤;3.敲减LncRNA OIP5-AS1和过表达miR-223,肺组织中NLRP3炎性小体表达减少,促炎因子IL-1 β、IL-6和IL-18表达减少,抗炎因子IL-10表达增加,ROS和MDA水平降低,SOD水平升高;小结:敲减 LncRNA OIP5-AS1和过表达 miR-223,通过 LncRNA OIP5-AS1/miR-223/NLRP3信号通路,减轻LPS诱导的ARDS大鼠的肺部损伤,抑制肺部炎症反应、氧化应激反应,抑制肺部细胞焦亡。结论（1）LncRNA OIP5-AS1 和 miR-223 参与 ARDS 发生发展。（2）抑制LncRNA OIP5-AS1或过表达miR-223均可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡、细胞焦亡,减轻炎症反应和氧化应激反应;LncRNA OIP5-AS1与miR-223、miR-223与NLRP3之间存在靶向关系,LncRNA OIP5-AS1通过吸附miR-223激活NLRP3信号通路参与LPS致HPMECs的损伤作用。（3）敲减 LncRNA OIP5-AS1和过表达 miR-223,通过 LncRNA OIP5-AS1/miR-223/NLRP3信号通路,抑制肺部炎症反应、氧化应激反应,抑制肺部细胞焦亡,减轻LPS诱导的ARDS大鼠的肺部损伤。