新型Eg5靶向抑制剂S-(methoxytrityl)-L-cysteine治疗前列腺癌的实验研究

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研究背景前列腺癌(prostate cancer)是世界范围内男性的第二大恶性肿瘤,2008年全世界大约有903,500例新发前列腺癌病人。在欧美等西方国家,前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤,同时也是致死性第二位的恶性肿瘤,2009年美国大约有27,360人死于去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)。亚洲国家前列腺癌的发病率和死亡率低于西方国家,但近年来随着生活习惯的改变及人口老龄化增加,前列腺癌在中国等亚洲国家呈现快速增长的趋势。目前我国前列腺癌的发病率仅低于膀胱癌和肾癌,已居泌尿系恶性肿瘤的第三位,并且发病年龄也日趋年轻化,前列腺癌已经成为临床上老年男性常见恶性肿瘤之一。自从1941年,Huggins创立了雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy,ADT),现在包括手术去势和LHRH类似物的药物去势为主的雄激素剥夺疗法,已成为对于外科手术或放射治疗不能奏效的进展期前列腺癌病人的标准治疗方法。一般来说,这些病人最初1-2年内对雄激素剥夺疗法有效,但是随后绝大部分进展为CRPC。2004年,发表在新英格兰杂志的SWOG9916和TAX327两项研究证实了以多西紫杉醇(docetaxel)为基础的联合化疗在治疗CRPC中的重要作用。基于以上两项研究的成果,FDA批准以多西紫杉醇为基础的联合化疗为CRPC的一线治疗,这一方案现已成为临床上CRPC的标准治疗方案。但是,当CRPC患者病情继续进展,临床上尚无有效的标准治疗方案或者处理共识。并且多西紫杉醇等抗微管类的药物,由于同时作用于有丝分裂期和间期的微管,抗癌的选择性较差,会对神经细胞造成损害而出现神经病变等神经毒性副作用,容易引起β-微管蛋白上药物结合位点的变异及P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和p-微管蛋白的过表达而产生相应的副作用,并能引起多重耐药性(multidrug resistance, MDR);这些都限制了抗微管药物的临床疗效和应用。多西紫杉醇耐药性CRPC患者平均生存期通常低于1年。因此,急切需要我们发展新的替代治疗策略,以延长患者的生存期和提高患者的生存质量。肿瘤细胞进入细胞周期后,其有丝分裂不受调控,导致不断的生长增殖。现在临床广泛应用的多西紫杉醇等抗微管类细胞毒性药物正是对细胞有丝分裂进行干扰从而抑制肿瘤细胞的增殖。Eg5,又被称作纺锤体驱动蛋白,在细胞有丝分裂早期对双极纺锤体的形成和复制染色体的分离起着至关重要的作用,表达于增殖的组织细胞中,已成为一个极具吸引力肿瘤化疗靶点。研究表明,Eg5蛋白高表达于恶性增殖的组织细胞中,但在稳定成熟分化的组织细胞如机体的神经细胞中未见其表达。研究证实,Eg5蛋白作为新的抗有丝分裂药物的靶点进行肿瘤化疗时,对机体正常组织无影响,临床应用副作用少,无抗微管药物类似的神经毒性副作用。1999年Science报道了第一个小分子Eg5蛋白抑制剂]monastrol,由于其能诱导单星样纺锤体(monoastral spindle)的形成而得名,该药能特异性的结合Eg5蛋白并抑制其功能,诱导增殖的肿瘤细胞停滞在有丝分裂期,并促使细胞凋亡。Eg5蛋白抑制剂不作用于微管,不能被P-糖蛋白转移到细胞外,可克服由于P-糖蛋白过表达而引起的多重耐药性,故对紫杉烷类耐药的肿瘤也能起到有效的治疗效果。鉴于monastrol的有效的抗肿瘤细胞增殖作用,大量小分子Eg5抑制剂被相继研究开发出来。STLC (S-trityl-L-cystein)是Dimitrios A等于2004年首先发现证实的有效的小分子Eg5蛋白抑制剂,与monastrol具有相同Eg5结合位点,与Eg5结合更加紧密、特异性更高,抗细胞增殖的能力比monastrol提高了约36倍。日本京都大学对STLC进行化学修饰后,首先发现报道了S(MeO)TLC (S-(methoxytrityl)-L-cysteine),一种强有力的细胞渗透性小分子Eg5蛋白抑制剂,在测试的STLC衍生物中抗细胞增殖的能力最强。S(MeO)TLC能特异性的与Eg5蛋白结合,诱导单极纺锤体的形成,其抑制细胞增殖的能力比STLC提高了10倍。最近京都大学药学部又研制了KPYC10665(2-(trifluoromethyl)-9H-carbazole), KPYC10666(2-(tert-butyl)-9H-carbazole)和KPYC10728(7-(trifluoromethyl)-9H-pyrido[3,4-b]indole)等多种联芳类有效的Eg5抑制剂。我们的前期研究已经报道了S(MeO)TLC作为新型的Eg5蛋白靶向抑制剂,在膀胱癌、肾癌中表现出强有力的抗癌效能,并且相比以往报道的大量Eg5抑制剂,有效给药浓度更低、疗效更好、安全性和靶向特异性更高。目前尚没有研究系统的探讨临床前列腺癌标本及前列腺癌细胞株中Eg5蛋白的表达,也没有关于Eg5抑制剂特别是S(MeO)TLC对前列癌的体内外治疗效果及机制的系统研究。所以,我们设计了本实验,从而为前列癌的临床诊断及靶向治疗提供有效的新型方法。目的检测前列腺癌临床标本及前列腺癌细胞中Eg5蛋白的表达水平,以探讨Eg5蛋白是否可以作为前列腺癌治疗的有效靶点,并探讨S(MeO)TLC这种新型的Eg5抑制剂对前列腺癌的体内外抗癌效能及机制。方法(1)分别应用免疫组织化学染色的方法检测由80例临床局限性前列腺癌标本构建的组织芯片(tissue microarray, TMA)和用Western Blot免疫蛋白印迹方法检测人前列腺癌细胞株PC3,DU145和LNCaP中Eg5的表达,分析探讨Eg5蛋白是否可以作为前列腺癌治疗的有效靶点。(2)体外实验:采用MTT和台盼蓝染色细胞活性实验法检测KPYC10665、 KPYC10666、KPYC10728、STLC和S(MeO)TLC这5种Eg5抑制剂对前列腺癌细胞的抗增殖作用,计算出药物的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration, IC50);并通过Hoechst细胞核染色细胞凋亡检测法,流式细胞仪细胞周期分布检测法和免疫荧光法进一步探讨S(MeO)TLC抗前列腺癌细胞的增殖并诱导前列腺癌细胞体外凋亡的效果和机制;最后采用蛋白免疫印迹方法检测S(MeO)TLC诱导前列腺癌细胞凋亡中Caspase途径相关蛋白表达,探讨S(MeO)TLC诱导前列腺癌细胞凋亡的分子通路机制。(3)体内试验:构建稳定表达荧光素酶的前列腺癌细胞株PC3Luc,然后评估S(MeO)TLC对PC3Luc皮下移植肿瘤模型的治疗效果;并用H&E染色的方法检测皮下种植肿瘤标本的情况,进一步探讨S(MeO)TLC体内抑制肿瘤增殖的机制。结果(1)PC3,DU145和LNCaP三种前列腺细胞中均检测到了Eg5表达。超过一半(44/80)的临床前列腺癌标本中也检测到了Eg5表达,并且前列腺临床标本中Eg5表达与Ki67标记指数(ki67labeling index)成显著相关(P=0.004)。(2)体外实验结果表明S(MeO)TLC比其他4个测试的Eg5抑制剂表现出更强的抗前列腺细胞增殖作用,通过诱导增殖细胞停滞在有丝分裂期并形成典型的单极纺锤体细胞,随后同时激活内源性和外源性Caspase依赖性凋亡途径诱导前列腺癌细胞发生凋亡。(3)体内实验表明S(MeO)TLC对前列腺细胞皮下移植瘤模型显著的抑制作用(P<0.05)也是通过诱导细停滞在有丝分裂期而实现的。结论(1)临床前列腺癌标本和前列腺癌细胞均存在Eg5蛋白的表达,Eg5蛋白可作为新型靶向化疗药物的有效的治疗靶点。(2)体内实验及皮下种植肿瘤实验均证实S(MeO)TLC作为新型Eg5蛋白靶向小分子抑制剂通过将前列腺癌细胞及异种种植肿瘤细胞有丝分裂期停滞而抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞同时经内源性和外源性caspase依赖性途径发生凋亡。(3) S(MeO)TLC可通过腹腔注射的方式给药,且是安全可靠的,并且其抑制体内外前列腺肿瘤生长的效果要显著强于STLC等其他Eg5抑制剂。(4) S(MeO)TLC是一种对前列腺癌有效的、有前途的抗癌药物。创新及意义(1)国内外首次分析了局限性前列腺癌临床标本中Eg5蛋白表达水平,为前列腺癌临床诊断提供依据。(2)国内外首次证实了Eg5蛋白可以作为前列腺癌治疗新的有效靶点。(3)国内外首次对新型Eg5抑制剂S(MeO)TLC治疗前列腺癌的实验疗效进行了研究;首次研究了S(MeO)TLC治疗前列腺癌的体内外治疗效果及机制。系统证明了S(MeO)TLC是一种对前列腺癌有效的、有前途的抗癌药物,并为前列腺提供创新性的靶向化疗方案。
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