研究背景脑卒中是一种高死亡率和高残疾的常见临床疾病,严重危害人类健康。其中,缺血性脑卒中占脑卒中总病例数的60%-70%。缺血后大脑神经元因缺氧而大量死亡是其最主要的损伤机制。因此,寻找有效的方法来减少神经元死亡是当前缺血性脑卒中治疗的研究热点。近年来,大量研究表明,缺血性脑卒中发生后,神经元周围的星形胶质细胞将发生反应性迁移和增殖。作为神经系统微环境的重要组成部分,星形胶质细胞对脑缺血缺氧后神经元细胞的存活具有重要调节作用。目前的研究证实,在缺血性脑卒中发生过程中,星形胶质细胞通过多种途径释放信号分子并与其他中枢神经系统细胞发生相互作用。例如,脑缺血后星形胶质细胞可通过释放HMGB1来促进血管内皮细胞的增殖。但是,关于脑缺血后星形胶质细胞是否直接调节神经元细胞存活的研究目前很少。缺血引起的缺氧对人体细胞或机体组织而言是一种巨大的刺激,这种刺激使得多种细胞短时间内分泌大量外泌体。外泌体是直径为30-150nm的囊泡,它们源自细胞内溶酶体颗粒形成的多囊泡体,可被细胞主动分泌。外泌体的外膜与细胞膜接触并发生融合,然后被释放到细胞外基质中。由于外泌体的脂质双层膜结构,它们可以很好地保护其覆盖的物质,其中包含了蛋白质,脂质和遗传物质。外泌体主要作用是在细胞之间转移蛋白质和RNA,并发挥细胞之间分子信号交流的作用。之前的研究发现缺氧预处理的人脐静脉内皮细胞分泌的外泌体可降低创伤性脑损伤导致的神经炎性反应,减少皮质损伤面积,改善脑损伤后小鼠的运动功能。自噬是细胞的一种进化保守的基本生命活动。它主要通过隔离非必需的细胞成分并在溶酶体中降解来维持细胞稳态。但在缺血性脑卒中发生后,缺血半暗区的神经元细胞会发生过度自噬,导致大量该区域的神经元死亡,使患者的病情进一步的恶化。circRNA是一种具有独特共价闭合环状单链的内源性非编码RNA。能够抵抗RNA外切酶的破坏,因此相比mi RNA和Lnc RNA具有更高的稳定性,可以在细胞之间作为信号因子传递,从而发挥相应的功能。有研究显示,神经干细胞来源的外泌体可以通过其携带的circ RNA修复缺血性肌肉损伤。然而,缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中circ RNA对于遭遇缺氧性损伤的神经元是否能发挥神经保护作用仍然未知。Circ RNA上有大量的mi RNA结合位点,它们通过碱基互补竞争性结合mi RNA,抑制mi RNA结合m RNA的能力,进而削弱mi RNA对靶基因表达的调控。这种通过序列互补竞争结合mi RNA的这种方法称为“mi RNA海绵”。Circ RNA作为mi RNA海绵发挥吸附作用是目前众多circ RNA相关研究中探讨最广泛的作用机制,也是某些circ RNA调节下游靶基因功能的主要模式。在细胞生长、细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等生物学过程中circ RNA发挥着重要的作用。最新研究成果显示,患者发生短暂缺血性脑卒中后,其脑组织中的Circ RNA HECT域E3泛素蛋白连接酶1（circ RNAHECTD1）水平升高,而circ RNAHECTD1可以充当mi R-142的海绵并通过调控自噬影响星形胶质细胞的存活。因此,本研究将致力于研究缺氧预处理星形胶质细胞外泌体来源的circ RNA在缺血性脑卒中病理进程中所可能存在的调控机制,为今后临床治疗缺血性脑卒中提供新的研究方向。第一部分 缺氧预处理星形胶质细胞提取的外泌体对缺氧性神经损伤的治疗作用目的 本研究将主要关注缺氧预处理星形胶质细胞分泌的外泌体对缺氧损伤后神经元存活能力的影响。方法 我们在体外构建氧-糖剥夺/再灌注星形胶质细胞（Ischemia-like Hypoxic Preconditioning Astrocytes,IPAS）并采用超高速离心提取IPAS培养上清液中的外泌体。Western Blot分析鉴定外泌体表面标志蛋白的表达;透射电镜观察外泌体的形态;采用Zetasizer-Nano-ZS方法测量所得外泌体的直径。使用红色荧光染料Dil标记外泌体并观察神经元细胞摄取外泌体的情况。通过TUNEL染色实验和LDH检测实验研究以确定IPAS外泌体对缺氧损伤后神经元存活能力的影响。进一步地,通过Western Blot分析IPAS外泌体调控神经元缺氧耐受的机制。最后,建立小鼠的大脑缺血再灌注损伤模型,将经过缺氧预处理星形胶质细胞外泌体注射至小鼠颅内,通过体内实验验证IPAS外泌体能够减轻缺血性脑卒中造成的脑组织损伤,并能够加快小鼠大脑神经功能恢复。结果 外泌体鉴定结果显示高速离心法提取的外泌体是具有纳米尺寸的均质球体,其平均大小分别为91nm±0.3nm;Western-blot结果显示提取的外泌体表面中富含CD9,ALIX,TSG101和CD63。我们还证实该外泌体可以被神经元摄取。进一步地,我们发现IPAS外泌体能够减弱缺氧损伤引起的神经元凋亡,且western-blot结果提示外泌体可通过抑制神经元过度自噬发挥神经保护作用。最后,体内实验结果显示,注射IPAS外泌体可以在构建小鼠短暂脑缺血模型3天后显著减少小鼠脑梗塞体积,提高小鼠大脑支配的行为功能恢复。结论 本研究初步证明缺氧预处理星形胶质细胞分泌的外泌体能够对遭遇缺氧损伤的神经元及脑组织发挥神经保护作用。第二部分IPAS-EXOs来源的circ SHOC2调控缺氧神经损伤目的探讨缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中的高表达的circ RNA对遭受缺氧损伤神经元细胞的作用。方法首先,我们使用circ RNA微阵列芯片筛查了缺氧预处理星形胶质细胞外泌体（IPAS-EXOs）和正常供氧星形胶质细胞外泌体中circ RNA表达的差异,通过实时荧光定量PCR技术验证芯片检测筛选出的circ RNA在IPAS-EXOs中的表达水平,并根据PCR验证的结果进一步筛选出目标circ RNA。其次,我们利用原位杂交技术确定circ SHOC2在神经元细胞中的主要分布部位。进一步地,我们将氧糖剥夺/再灌注处理过的小鼠大脑皮层神经元细胞与circ SHOC2模拟物（circ SHOC2mimics）或circ SHOC2抑制剂（circ SHOC2 inhibitor）共培养,通过LDH检测和TUNEL染色法评估神经元细胞的活力,Western-blot检测与细胞凋亡和自噬有关的蛋白质表达变化。最后,利用质粒将circ SHOC2 mimics或circ SHOC2 inhibitor移植到大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠的颅内。根据改良的神经功能缺损评分（m Nss）、2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）染色和TUNEL染色的研究结果,探讨circ SHOC2对缺氧性脑梗死和神经功能缺损的修复作用。结果在体外实验中,环状RNA SHOC2（circ SHOC2）在缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中表达明显升高。过表达神经元细胞中的circ SHOC2可逆转缺氧性损伤诱导的神经元细胞活力降低,且减少凋亡蛋白表达。此外,Western blot结果显示,circ SHOC2的过度表达可抑制凋亡相关蛋白Caspase-3、自噬相关蛋白LC3-II和p62的表达。因此我们认为缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中过表达的circ SHOC2主要是通过抑制神经元过度自噬而发挥神经保护作用。体内实验进一步证实,转染circ SHOC2模拟物后,MCAO模型小鼠的脑梗死体积被显著减少,且明显改善了MCAO模型小鼠的神经功能恢复;相反,特异性抑制神经元中circ SHOC2的表达可加重MCAO模型小鼠的神经功能损伤,并且小鼠脑梗死体积也较对照组明显增加。结论缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中过表达的circ SHOC2抑制了缺氧损伤诱导的神经元凋亡。并且通过抑制神经元过度自噬,减少梗死体积,促进神经功能恢复。第三部分circ SHOC2通过靶向mi R-7670-3p调控SIRT1影响缺氧条件下神经元的存活目的本研究初步探索了缺氧预处理星形胶质细胞外泌体中过表达的circ SHOC2发挥神经保护作用的机制及其具体的调控信号通路。方法首先,我们使用star Base等circ RNA-mi RNA预测数据库对可能与circ SHOC2结合的mi RNA进行筛选。随后通过q RT-PCR分析、pull-down下拉分析等实验初步验证我们筛选出的目标mi RNA;其次,通过分子克隆技术我们构建了circ SHOC2和目标mi RNA的luciferase荧光素酶报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reports assay）实验进一步证实circ SHOC2与目标mi RNA之间存在结合位点。进一步地,通过点突变circ SHOC2或目标mi RNA,利用荧光原位杂交技术直观的观察circ SHOC2结合目标mi RNA的能力。接下来,利用多个生物信息学分析软件（starbase、Targetscan和mi Rnada）的结果预测出目标mi RNA调控的下游神经保护相关靶基因,并利用双荧光素酶报告基因检测分析技术和q RT-PCR分析技术验证目标mi RNA与靶基因的相互结合能力。最后,通过小鼠体内实验,我们特异性过表达或抑制小鼠颅内目标mi RNA的表达水平,评估目标mi RNA对MCAO模型小鼠神经功能恢复和下游靶基因表达水平的影响;最后利用Western-blot技术验证调控神经元中circ SHOC2的表达水平对该靶基因表达水平的影响。结果生物信息学分析发现,circ SHOC2存在mi R-7670-3p结合位点。基因预测软件和双荧光素酶报告基因检测结果证实circ SHOC2在缺氧损伤神经元中起到“分子海绵”的作用,下调mi R-7670-3p的表达水平。双荧光素酶报告基因分析、q RTPCR分析和Western blot等一系列实验证实,circ SHOC2可以作为内源性mi R-7670-3p海绵抑制mi R-7670-3p的活性,并影响mi R-7670-3p下游SIRT1的表达,从而抑制缺氧引起的神经元致死性自噬。因此,我们发现circ SHOC2/mi R-7670-3p/SIRT1信号通路通过抑制神经元过度自噬并减轻缺血性脑卒中造成的神经元损伤,从而增强脑卒中后神经功能的恢复。结论circ SHOC2可以作为神经元中mi R-7670-3p的分子海绵正向调控SIRT1的表达,并通过调控circ SHOC2/mi R-7670-3p/SIRT1信号通路对缺血性脑卒中后缺血半暗区的神经元功能发挥保护作用。