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T-2毒素(T-2)与HT-2毒素(HT-2)均属于A类单端孢霉烯族毒素,为梨孢镰刀菌次级代谢产物。T-2/HT-2在自然界中广泛分布,摄入体内可对人畜健康造成损伤,在各组织器官中残留,并导致动物发生氧化应激与细胞凋亡。肉鸡对T-2较敏感,低剂量毒素便可产生毒性作用,引起其采食量下降、口腔损伤、消化道溃疡及体重减轻等。在肉鸡饲喂过程中向饲料中添加物理性吸附剂可有效防止毒素对肉鸡的损害。T-2可导致细胞活性降低、死亡率增高,发生氧化应激和细胞凋亡。目前,研究T-2/HT-2对动物的毒性作用报道较少,而且尚无相关文献报道两种毒素对肉鸡体内、体外的毒性作用。因此,本文主要从体内、体外两方面研究T-2/HT-2对肉鸡的毒性机理及减控作用。首先建立了一种可检测肉鸡体内T-2/HT-2的液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法,随后采用梨孢镰刀菌接种玉米获得发霉玉米作为毒素来源,研究肉鸡自由采食发霉玉米后毒性作用及在体内的残留情况。由于肝是T-2产生毒性作用的靶器官,因此,体外试验选择肝细胞作为研究对象。通过灌流法分离获得原代鸡肝细胞,研究T-2/HT-2对肝细胞的毒性与细胞凋亡相关机理。然后,通过向细胞培养基中添加有机硒,研究其对细胞毒性与氧化应激的减控作用。最后,向发霉饲料中添加蒙脱土,研究其对T-2/HT-2产生毒性的减控作用。首先建立一种检测肉鸡体内T-2与HT-2的方法,即利用HPLC-MS/MS检测心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃、小肠、肌肉、骨骼及脑中T-2/HT-2的含量。该方法利用乙酸乙醋萃取毒素,然后用C18反相柱(50×2.1 mm,3μm)分离毒素,最后质谱仪在正离子模式(ESI+)下分析毒素。该方法检测限(LOD)为0.02～0.05μg·kg-1,定量限(LOQ)为0.08～0.15μg·kg-1;样品回收率为58.5～110.5%,相对标准偏差(RSD)小于17.0%;基质效应(Matrix effect,ME)为33.3～124.9%,RSD小于17.1%。日内、日间精密度及样品稳定性RSD均低于14.7%。然后用梨孢镰刀菌接种获得发霉玉米,检测霉玉米中相关毒素含量。根据玉米中T-2含量,将发霉玉米以不同比例与正常饲料混合,分为对照组(正常饲料)、低剂量组(1 mg·kg-1 T-2)、中剂量组(2 mg·kg-1 T-2)及高剂量组(4 mg·kg-1 T-2),1日龄肉鸡自由采食42d。检测各组肉鸡的生理指标、生化指标、病理变化、骨计量指标、毒素残留及氧化应激及细胞凋亡相关mRNA的表达。结果显示:与对照组比较,毒素组肉鸡体重显著下降,增重降低,料肉比(FCR)显著升高(P<0.05)。血清中碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)与天门冬氨酸氨基转移酶(AST)显著升高,总蛋白(TP)显著降低(P<0.05)。股骨与胫骨密度、刚度、弯曲的杨氏模量及最大载荷显著下降(P<0.05)。T-2/HT-2在肉鸡各组织器官中不同程度残留。肝氧化应激与细胞凋亡相关mRNA表达也显著上调(P<0.05)。随后用不同剂量的T-2/HT-2处理灌流法分离的原代鸡肝细胞。通过测定细胞活性(MTT法)、细胞形态(苏木素-伊红染色)及ALT/AST活性评价毒素产生的细胞毒性作用。T-2/HT-2会引起细胞凋亡,在荧光显微镜下观察凋亡细胞(Hoechst 33342染色及TUNEL法),并测定细胞凋亡率和凋亡时期(Annexin V-FITC与PI双染色法);然后用50nM T-2/HT-2与肝细胞孵育不同时间,检测细胞凋亡相关蛋白(Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9、P53、Bcl-2、Bax)在基因水平(荧光定量PCR)与蛋白水平(蛋白质印迹技术)的相对表达量。与对照组相比,毒素组细胞活性显著降低(P<0.05),细胞体积与数量减少,死亡细胞数增加,培养基中ALT/AST活性显著增强(P<0.05);凋亡细胞显著增加,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),肝细胞凋亡多为早期凋亡。50 nM T-2/HT-2处理细胞后,凋亡相关基因与蛋白发挥作用的时期集中在细胞染毒后0～24h之间。与Oh细胞相比,不同时间点Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53基因相对表达量均表现不同程度上调(P<0.05),而Bcl-2基因相对表达量无显著差异(P>0.05)。在0～24h之间,Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53蛋白表达量均随时间推移显著上调(P<0.05),而Bcl-2表达量随时间推移显著下调(P<0.05)。不同剂量T-2/HT-2与原代肝细胞共孵育24 h,并向肝细胞培养液中添加DL-硒代蛋氨酸,通过测定细胞活性(MTT法)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率评价DL-硒代蛋氨酸对肝细胞损伤的减控作用。随后测定细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)水平,检测谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、GSH-PX、SOD及CAT mRNA相对表达量,评估DL-硒代蛋氨酸对氧化应激减控作用。结果显示,与对照组相比,毒素组细胞活性显著下降,LDH漏出率显著升高,ROS及MDA水平显著上升,细胞内GSH含量显著下降,而胞内抗氧化酶(GSH-PX、SOD及CAT)活性显著升高,氧化应激相关mRNA(GST、GSH-PX、SOD及CAT)表达量显著提高(P<0.05)。与相应剂量的毒素组比较,试验组细胞培养基添加DL-硒代蛋氨酸,可显著增加肝细胞活性,降低LDH漏出率,减少胞内ROS和MDA水平,提高GSH、GSH-PX、SOD及CAT水平,且氧化应激相关mRNA表达量显著上调(P<0.05)。通过T-2体外吸附试验,确定蒙脱土是对T-2吸附率最高的吸附剂,以5g·kg-1的比例添加入霉饲料中,评价蒙脱土对T-2/HT-2毒性的减控作用。将肉鸡分为对照组、脱毒对照组(5g·kg-1蒙脱土)、毒素组(4 mg·kg-1 T-2)与脱毒组(4 mg·kg-1 T-2+5g·kg-1蒙脱土)。1日龄肉鸡自由采食42 d,检测肉鸡的生理及生化指标、病理变化、骨计量指标、毒素残留及氧化应激及细胞凋亡相关mRNA的表达。结果显示:与毒素组比较,饲料中添加蒙脱土脱毒组肉鸡体重、增重、采食量、骨密度、骨刚度、弯曲的杨氏模量及最大载荷均显著升高(P<0.05),FCR、ALP、AST、ALT以及氧化应激与细胞凋亡相关mRNA均显著降低(P<0.05)。而且脱毒组肉鸡体内各器官中T-2/HT-2含量明显低于毒素组相应器官中的毒素含量(P<0.05)。结论:本文建立的HPLC-MSMS检测方法,可快速、有效检测组织器官中T-2/HT-2残留;同时可将该方法进行推广,作为检测肉鸡畜产品中毒素检测的标准方法。肉鸡采食梨孢镰刀菌污染的玉米后,霉玉米中的T-2/HT-2可导致肉鸡产生各方面的毒性作用,并在肉鸡体内残留,还可诱导肉鸡肝脏氧化应激与细胞凋亡。随后,选择肝作为体外研究对象,发现T-2/HT-2可造成肉鸡肝细胞产生毒性作用,并诱导细胞凋亡,且凋亡相关基因与蛋白在细胞凋亡机制中发挥重要作用。T-2/HT-2还可诱导肝细胞出现氧化应激,向肝细胞培养液添加DL-硒代蛋氨酸可显著降低毒素对肝细胞的损伤,缓解肝细胞氧化应激。而向发霉饲料中添加蒙脱土可减控霉饲料中T-2/HT-2对肉鸡的毒性作用,减少T-2/HT-2在各组织器官中残留,缓解肝氧化应激和细胞凋亡。