小肠蔗糖酶的分离纯化及部分性质

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对猪小肠蔗糖酶(Sucrase,E.C.3.2.1.26)在分离纯化的基础上,对其性质进行了初步研究。将猪小肠匀浆后的粗提取物进行分段盐析、DEAE-Sepharose柱层析及Sephacryl S-200、Sephadex G-200凝胶过滤等纯化步骤,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带,比活力为1.79units/mg蛋白的酶制品,经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条区带,该酶的亚基相对分子质量为51000。等电聚焦显示其等电点(pI)为6.7。氨基酸组成分析表明:猪小肠蔗糖酶由约477个氨基酸残基组成,富含甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、门冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸。圆二色谱(CD)对其二级结构的分析显示,蔗糖酶分子中α-螺旋占28.8%,β-折叠占27.9%,无规则卷曲占43.2%。通过动力学方法测得该酶的最适pH值为6.9,最适温度为50℃,以蔗糖为底物的米氏常数Km为18.9mmol/L。该酶在40℃以下时比较稳定。用化学修饰法测得该酶的功能基团是半胱氨酸的巯基,对氯汞苯甲酸(PCMB)对蔗糖酶的抑制作用为反竞争性抑制,其抑制常数Ki为0.75mmol/L。二巯基苏糖醇(DTT)修饰,NR/R单向SDS-PAGE、NR/R双向对角线SDS-PAGE的结果均表明蔗糖酶分子内没有二硫键存在。 各种金属离子对该酶的影响表现为:K+、Fe2+、CO2+、Al3+及Sb3+对蔗糖酶活力影响不大;Zn2+、Mg2+、Mn2+对蔗糖酶活力有不同程度激活作用,其中Zn2+的激活作用最强:Li+、Ni2+、Ca2+、pb2+、Cd2+、Hg2+、Ag+、Cr3+及EDTA对蔗糖酶活力则有不同程度的抑制作用,其中Ag+的抑制作用最强。在这些金属离子中,过渡金属离子Ni2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、和Zn2+在低浓度时对蔗糖酶有不同程度激活作用,随离子浓度增大,Zn2+激活作用明显加强,在含5mmol/L Zn2+的反应体系中酶活力为140%;Mn2+、Co2+激活作用增加不明显;Ni2+表现出轻微抑制作用;而 CU卜在随其浓度上升过程中对酶活力的作用却表现为先激活后抑制,在 含 lmmol/L CuZ”的反应体系中酶活力增加了 13石%,在含 3mmol/L Cuy 的反应体系中酶活力基本没有改变,在含 smmol几 Cuy的反应体系中酶 活力被抑制了 41.7%。重金属离子 Ag\ Hgh、Cd卜对蔗糖酶活力的抑 制作用随离子浓度增大而增加,smmol几 Ag“可完全抑制蔗糖酶的活性。 EDTA对蔗糖酶活性的抑制作用随其浓度增加呈线性增加。 中药材中苍术、桔梗、桑白皮、知母、五味子、麦冬、桑叶、淫羊 霍、丹皮、白术、乌梅、黄精、地黄、苍耳于、玉米须、冤丝子、玄参、 泽泻和玉竹的75%乙醇提取液对蔗糖酶有不同程度的抑制作用,其中苍 术、桔梗、桑白皮提取液的抑制作用较强,0.lmllo%苍术、桔梗、桑白 皮75%乙醇的提取液分别使酶活力下降了刀刀%、52.7%和52.6%;仙鹤 草、女贞子、天冬、石膏、人参和获菩的75%乙醇提取液对蔗糖酶活力 影响不大;花粉、地骨皮、红参、黄蔑、三七、山药、黄莲和丹参的75% 乙醇提取液对蔗糖酶有不同程度的激活作用,其中丹参的激活作用最 强,0刁ml 10%丹参的75%乙醇提取液使酶活力增加了41%。调味料中 大蒜对蔗糖酶有轻微激活作用,姜和花椒对蔗糖酶的活力影响不大,而 辣椒和胡椒则有不同程度的抑制作用。其中胡椒碱对蔗糖酶的抑制作用 随浓度增加而明显加强。当其浓度达到smmol几时,蔗糖酶活力仅剩余 12.7%。背角无齿蚌多糖对蔗糖酶有很强的激活作用。且随其浓度增加, 激活作用加强。当其浓度达到sing加l时,蔗糖酶活力高达225%。
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