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目的:近些年,胰腺癌发病率在全球范围内呈明显上升趋势。中国国家癌症中心最新统计数据显示在中国城市恶性肿瘤发病率中,胰腺癌占男性恶性肿瘤发病率的第8位,居大城市人群恶性肿瘤死亡率的第6位[1-3]。由于胰腺癌起病隐匿、早期亦转移、治疗效果不佳等特点,导致患者就诊时即处于中晚期,失去了根治性手术治疗的机会。为了提高胰腺患者的预后,需要我们对胰腺癌的发生、发展的相关机制进行更为深入的研究。肿瘤的发生、发展与细胞内氧化还原稳态的失衡密切相关,而作为维持细胞内氧化还原稳态的核心转录因子之一的核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2,NRF2/NFE2L2）在其中的作用就显得尤为重要。其通过调控下游抗氧化基因的转录和翻译,发挥其生物学效应。越来越多的文献报道证实,NRF2在不同类型的肿瘤,甚至同一肿瘤的不同进展阶段,其介导的作用也截然不同,即对肿瘤的发生、发展具有双向调节作用。鉴于目前尚无特异性的体内实验研究NRF2在胰腺癌发生、发展中的作用,且缺乏NRF2在人胰腺癌有氧糖酵解等恶性生物学表型中的特异性报道。综上所述,本研究利用胰腺组织特异性Nrf2敲除的Kras突变小鼠模型和NRF2沉默的人源性胰腺癌细胞系,探讨NRF2在胰腺癌发生及恶性生物学行为中的作用及机制,为胰腺癌的防治提供新的理论依据。研究方法:1.首先,从TCGA公共数据库下载人胰腺癌转录组数据集和相关临床资料数据集,分析NRF2在胰腺癌组织和正常组织中的差异表达情况及NRF2的表达水平与患者一般临床资料、病理资料和预后的相关性。采用免疫组织化学染色、q RT-PCR及Western Blot方法检测本科室收集的12对胰腺癌组织和其对应的癌旁组织NRF2及其下游靶基因的表达情况,同时收集患者入院时血清CA19-9水平指标,对两者表达水平进行相关性分析,进一步验证其差异表达与患者的临床相关性。2.应用Nrf2Loxp/Loxp小鼠和Pdx1-Cre工具鼠,构建CN(Nrf2Loxp/Loxp;Pdx1-Cre)小鼠,实现胰腺组织特异性Nrf2敲除,观察Nrf2缺失对胰腺发育、胰腺内、外分泌功能的影响。同时,利用Nrf2Loxp/Loxp小鼠和胰腺癌前病变小鼠即胰腺组织特异性Kras突变的KC小鼠(LSL-KrasG12D/+;Pdx1-Cre),构建胰腺组织特异性Nrf2敲除的Kras突变小鼠模型,简称KCN小鼠(LSL-KrasG12D/+;Nrf2Loxp/Loxp;Pdx1-Cre),研究Nrf2在胰腺癌发生中的作用。上述小鼠每周监测体重、饮食和饮水情况,并分别于4、8、16周收集血液、胰腺组织样品,同时检测血清淀粉酶活性。胰腺组织病理进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）及免疫组织化学染色（CK-19、NQO-1、Ki-67、8-OHd G）;提取胰腺组织总RNA,对氧化应激、间质反应的相关基因进行转录水平检测;提取胰腺组织总蛋白对NRF2及下游靶基因和上皮细胞增殖反应的关键蛋白及其信号通路进行检测。3.利用q RT-PCR及Western Blot方法检测3种人源性胰腺癌细胞系（As PC-1、CAPAN2、PANC-1）和人正常胰腺导管细胞HPDE6-C7中NRF2及其下游靶基因的表达水平。此外,利用慢病毒转染技术实现在CAPAN2和PANC-1胰腺癌细胞中抑制或过表达NRF2,随后利用细胞计数、Ed U实验、单克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测过表达和抑制NRF2表达后胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。使用二代测序技术检测NRF2差异表达与EMT及糖酵解相关蛋白或转录因子的变化情况,同时对差异基因进行通路富集分析,使用WB、q RT-PCR对其进行验证,探讨NRF2在胰腺恶性生物学行为中的作用机制。结果:1.胰腺癌组织中NRF2的表达量较癌旁组织显著升高,且与患者的临床病理分级和血清CA19-9水平存在显著相关性,可作为判断患者预后的危险因素。使用TCGA数据库分析结果显示NRF2在胰腺癌组织表达量相较正常组织明显升高,使用收集的12对临床胰腺癌组织病理样本分析同样证实了NRF2及其下游靶基因在大多数胰腺癌组织（8/12）中高表达;对NRF2表达情况与患者临床资料分析发现:NRF2表达水平与患者胰腺癌疾病分期、原发病灶病理分级有关,而与患者性别、年龄、淋巴结及远处脏器转移无明显相关性;胰腺组织总NRF2表达水平与患者血清CA19-9水平存在显著相关性;NRF2表达水平与患者的总生存期、无进展生存期均存在显著相关性;多因素分析结果显示:NRF2表达水平是影响胰腺癌患者的预后的危险因素之一;NRF2表达水平可较好预测患者的预后。2.Nrf2缺失促进小鼠胰腺肿瘤的发生。KCN小鼠的生存期、体重较KC小鼠明显降低（P＜0.05）,C和CN鼠之间未见显著差异;各组小鼠在空腹血糖、胰腺重量中未见显著差异;各组小鼠血浆淀粉酶未见明显差异;HE、CK-19染色显示:在4周龄时,KC小鼠和KCN小鼠即出现了较明显的腺泡导管化生病理改变,且KCN小鼠腺泡导管化生病变较KC小鼠多且严重,C小鼠和CN小鼠未发生明显病变;8周龄时,KCN小鼠已出现较明显的Pan IN病变,KC小鼠未见明显Pan IN病变,但ADM病变较前加重,N小鼠和CN小鼠胰腺组织病理均未见明显病变;16周龄时,KC、KCN小鼠均出现较明显的上皮内瘤变,其中KCN小鼠Pan IN病变相较KC小鼠病理分级更高、病变范围更广,KC小鼠次之,部分CN小鼠（1/5）也可见Pan IN病变,C小鼠胰腺未见明显病变。Ki-67免疫组化染色显示:随着周龄的增加,KCN小鼠胰腺导管上皮细胞异型性增生明显,导管上皮细胞增殖能力明显增强,KC小鼠次之;NQO-1免疫组化染色和q PCR结果均显示:Nrf2缺失可显著降低胰腺组织抗氧化相关基因表达水平,在Nrf2缺失的小鼠（CN、KCN小鼠）中,Gclc、Gclm、Nqo-1、Ho-1的m RNA和蛋白水平分别较其他两组（C、KC小鼠）显著降低（P＜0.05）,其中以KCN小鼠降低更加明显（P＜0.01）;在8周龄和16周龄时,KCN鼠胰腺组织中Il-1β、α-Sma和Il-6的m RNA表达水平较同周龄其他组小鼠均显著增高,提示胰腺星状细胞活化明显;8-OHd G免疫组化染色显示:同周龄下,KCN鼠较KC鼠,DNA氧化损伤更为严重;16周龄KC和KCN小鼠胰腺组织中EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平均明显升高,以KCN鼠升高水平更为显著,提示KCN鼠胰腺组织内EGFR/PI3K/AKT通路高度活化,并借由此促进肿瘤发生。3.NRF2在胰腺癌细胞系中高表达,促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力,发挥促进胰腺癌进展的作用。细胞实验证实NRF2在3种人胰腺癌细胞株中明显高表达,其中以CAPAN2表达增加最为显著,As PC-1次之,PANC-1细胞表达升高最弱;使用慢病毒稳转沉默NRF2和KEAP1表达,通过细胞计数、细胞平板克隆实验、Ed U荧光染色实验结果均显示:过表达NRF2可显著增强细胞增殖能力,抑制NRF2则可降低细胞增殖能力（P＜0.05）;WB结果显示NRF2可通过IRS/PI3K/AKT/mTOR通路促进肿瘤细胞增殖。使用二代测序结果显示:NRF2与EMT相关基因及转录因子之间存在相关性,细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验结果均显示:过表达NRF2后PDAC细胞的迁移和侵袭能力明显增强,沉默NRF2后细胞迁移和侵袭能力明显抑制（P＜0.05）;q RT-PCR和Western blot实验证实:过表达NRF2显著促进PDAC细胞EMT相关蛋白及转录因子的表达;二代测序结果显示:NRF2与糖酵解相关基因的表达有关,随后我们使用q RT-PCR以及Western blot实验均证实抑制NRF2可显著降低细胞糖酵解相关基因和蛋白的表达,同时使用ECAR实验证明NRF2敲低后可显著降低糖酵解速率,提示NRF2促进肿瘤糖酵解的发生;进而促进细胞恶性生物学行为。结论:1.NRF2在胰腺癌组织高表达,且与患者的血清CA19-9水平、癌组织病理分级及预后存在显著相关性,并可作为判断患者不良预后的危险因素。2.Nrf2抑制小鼠胰腺肿瘤发生。3.NRF2在胰腺癌细胞系中高表达,通过IRS/PI3K/AKT/mTOR通路促进肿瘤细胞增殖,并可促进肿瘤细胞上皮间质转化和糖酵解的发生,进而调控胰腺癌的恶性生物学行为。