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目的急性淋巴母细胞淋巴瘤(Lymphoblastic lymphoma,LBL)和淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是起源于淋巴母细胞的恶性肿瘤性疾病,具有高度侵袭性。在当前的治疗方案下,其无病生存率(event-free survival,EFS)可以达到60-90%,但是复发患者的生存率仍然很低,仅为3-12%。临床研究表明,在接受Berlin-Frankfurt-Munster(BFM)类型治疗方案的急性淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-cell acute lymphoblastic lymphoma/leukemia,T-LBL/ALL)病人当中,携带NOTCH1突变相对非携带者而言是一个有利因素。同时,携带的NOTCH1功能激活突变可以反转携带不良预后因素PTEN突变的影响,而这种机制尚不清楚。因此全面深入理解NOTCH信号通路在肿瘤发生发展和诊断治疗中的作用尤为迫切。本课题旨在研究T-LBL/ALL中NOTCH1突变对T-ALL/LBL细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法1.探究 γ-secretase 抑制剂(γ-secretase inhibitor,GSI)Compound E 对 T-LBL/ALL耐药细胞系(MOLT-3,CUTLL1和JURKAT)对BFM 90方案(阿糖胞苷,甲氨蝶呤,长春新碱,柔红霉素)化疗药物敏感性的影响。(1).用不同浓度的 Compound E(100 nM,300 nM,1000 nM)和 control(DMSO)处理 T-LBL/ALL细胞系,72小时后,提取RNA,进行反转录,用qRT-PCR的方法在mRNA水平对NOTCH1信号通路下游因子的表达水平进行检测。(2).药物敏感试验。用 Compound E(100 nM)和 control(DMSO)作用于 T-LBL/ALL 细胞系,24小时后,加入不同梯度浓度的BFM90方案化疗药物,48小时后,用CCK-8法检测并比较两组T-LBL/ALL细胞系对BFM 90方案化疗药物敏感性的差异。2.用靶标NOTCH1的短发卡RNA(NOTCH1-shRNA)特异性抑制NOTCH1的表达,观察T-LBL/ALL细胞系(MOLT-3和JURKAT)对BFM 90方案化疗药物敏感性的差异。(1).将NOTCH1-shRNA和无义序列control质粒克隆至质粒pLKO.1-puro,进行慢病毒包装及浓缩。(2).构建稳定细胞株。用慢病毒转染的方法将质粒NOTCH1-shRNA以及control转染至T-LBL/ALL细胞系,嘌呤霉素进行筛选,并通过qRT-PCR和Western Blot的方法进行验证。(3).药物敏感试验。用不同梯度浓度的BFM 90方案化疗药物处理两组新构建的T-LBL/ALL细胞株,48小时后,用CCK-8法检测并比较两组T-LBL/ALL细胞系对BFM 90方案化疗药物敏感性的差异。3.检测T-LBL/ALL细胞系中NOTCH1信号通路下游相关蛋白表达水平的变化。(1).用 Compound E(100nM)和 control(DMSO)处理 T-LBL/ALL 细胞系,72小时后,提取细胞总蛋白,用Western Blot的方法在蛋白水平检测NOTCH1信号通路下游相关蛋白表达水平的变化。(2).用慢病毒转染质粒NOTCH1-shRNA和control构建的稳定细胞株,提取细胞总蛋白,通过Western Blot的方法在蛋白水平检测NOTCH1信号通路下游相关蛋白表达水平的变化。4.明确GSI以及NOTCH1-shRNA在T-LBL/ALL细胞系中对NOTCH1下游信号通路的影响。(1).用Compound E(100 nM)和control(DMSO)作用于T-LBL/ALL细胞系MOLT-3,72小时后,对两组T-LBL/ALL细胞系进行转录组测序,以明确NOTCH1信号通路下游在mRNA水平受GSI影响的效应分子。(2).根据转录组测序结果,对Compound E(100 nM)和control(DMSO)处理的T-LBL/ALL细胞系,用qRT-PCR和Western Blot方法分别在mRNA和蛋白水平再次验证GSI对T-LBL/ALL细胞系NOTCH1信号通路下游相关效应分子的表达变化,明确NOTCH1调节T-LBL/ALL细胞系化疗敏感性的桥梁PREX2。5.上调PREX2的表达,验证其对T-LBL/ALL细胞系化疗敏感性的直接影响。(1).将截短PREX2和无义序列control克隆至质粒pcw-107,进行慢病毒包装及浓缩。(2).构建稳定细胞株。用慢病毒转染的方法将表达截短PREX2和无义序列control的质粒转染至T-LBL/ALL细胞系(MOLT-3和JURKAT),通过嘌呤霉素进行筛选,并用Western Blot的方法进行验证。(3).慢病毒转染表达截短PREX2和无义序列control的质粒构建的稳定细胞株,提取细胞总蛋白,用Western Blot的方法在蛋白水平检测信号通路相关蛋白表达水平的变化。(4).药物敏感试验。用不同梯度浓度的BFM 90方案化疗药物处理两组T-LBL/ALL细胞系,48小时后,用CCK-8法检测并比较两组T-LBL/ALL细胞系对BFM 90方案化疗药物敏感性的差异。结果1.GSI和NOTCH1-shRNA对各种T-LBL/ALL细胞系的NOTCH1活性均有不同程度的抑制,而且对他们的化疗敏感性的影响也存在差异,以MOLT-3细胞影响最为显著,而对JURKAT细胞则最为微弱。2.NOTCH1在不同的T-LBL/ALL细胞中对PI3K-AKT信号通路的激活有不同程度的作用。3.RNA-seq技术提示GSI能够影响MOLT-3细胞多项基因的表达水平,经过分析验证,确认最有可能调节化疗敏感性的基因为PREX2。结论NOTCH1可能通过调节PREX2的表达水平,从而调节PI3K-AKT通路的激活水平,进而改变T-ALL细胞的化疗敏感性。