背景：糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一,一旦出现大量蛋白尿,肾功能将不可逆性进行性下降,最终发展为终末期肾病。由于其发病机制复杂,目前尚无理想的治疗方案。过去研究的重点聚焦在高血糖对糖尿病及其并发症的危害上,近些年人们认为脂肪酸代谢障碍是糖尿病及其并发症的原发病理生理改变。其中血游离脂肪酸升高在非脂肪组织蓄积造成的损伤,即脂毒性,既是糖尿病患者发病的可能病因之一,也是促进疾病进展和加重的关键因素。在糖尿病肾病中,脂毒性己被证实是进展性肾小管损伤的重要病理机制之一,并和肾脏疾病预后密切相关。电子转运黄素蛋白(electron transfer flavoprotein, ETF)是脂肪酸β氧化中12种线粒体脱氢酶的电子接受体,由α和β亚单位组成,存在于生物体细胞线粒体内。本实验室前期通过糖尿病肾病大鼠肾皮质蛋白组学研究发现ETFβ在保守序列位点出现点突变,提示其可能在糖尿病肾病发生发展中发挥重要作用。目的：本研究通过建立不同糖尿病肾病大鼠模型以观察ETFβ的表达和分布,及与糖尿病肾损伤之间的关系和机制；通过过表达和敲降技术,探讨ETFβ在棕榈酸(plamitate, PA)诱导的肾小管上皮细胞凋亡中所起的作用。综合体内外实验评价ETFβ在糖尿病肾病中的作用,为进一步深入认识糖尿病肾病发病机制提供新思路,同时为疾病治疗提供新的药物候选靶点。方法：体内实验分为两部分,首先分别通过链脲佐菌素腹腔注射合并高脂饲料喂养制备轻度肾损伤模型,及链脲佐菌素注射合并单侧肾切除诱导重度糖尿病肾损伤大鼠模型,探讨ETFβ在链脲佐菌素诱导的两种糖尿病肾病模型大鼠肾皮质中表达的变化。此外,通过2型自发性糖尿病OLETF大鼠模型,观察肾病进展的两个阶段,分别为36周龄的轻度肾损伤和56周龄的重度肾损伤。用Western blot和免疫组化方法检测ETFβ在正常及模型组大鼠肾皮质的分布和表达情况；固定肾组织通过PAS染色观察肾脏病理损伤,然后分析ETFβ的表达变化与糖尿病肾病发生发展之间的关系。此外,在OLETF大鼠模型中,分析肾损伤的机制：用TUNEL法检测两个时间点的细胞凋亡情况,然后通过Western b lot检测线粒体凋亡通路蛋白变化,包括胞浆细胞色素C、BAX、Bcl-2及Cleaved caspase-3的表达变化,此外检测肾组织NOX4的表达。体外实验部分,探讨ETFβ对脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制。首先通过敲降实验观察了ETFβ在低表达时对脂肪酸诱导的细胞凋亡的影响：设计并筛选出敲降效率高的ETFβ基因siRNA Oligo干扰序列,转染至大鼠近端肾小管上皮细胞NRK 52E,24h后在培养基中加入终浓度为05 mM PA,再过24 h后检测ROS生成,BAX、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表达,通过流式检测线粒体膜电位和细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡情况,比较脂肪酸诱导的细胞凋亡通路改变与敲降ETFβ合并脂肪酸刺激的差异,分析ETFβ低表达对脂毒性凋亡的影响。另一方面,通过构建ETFβ过表达重组质粒并转染至细胞,观察在ETFβ高表达时线粒体凋亡通路以及细胞凋亡率的变化,分析ETFβ过表达对脂肪酸诱导的NRK 52E凋亡的影响。结果：1 ETFβ表达与糖尿病肾病进展之间的相关性(1)ETFβ在链脲佐菌素诱导的不同糖尿病肾病大鼠模型中的表达：链脲佐菌素注射合并高脂饲料喂养建立的糖尿病肾病模型中,蛋白尿最大量为416 mg/24h,肾小管轻度损伤；在链脲佐菌素注射合并单侧肾切除诱导的糖尿病肾病模型中,蛋白尿达300mg/24h,肾小管上皮细胞出现玻璃滴样变和空泡变性,部分肾小管扩张或萎缩,管腔内可见蛋白样物质或蛋白管型,间质可见散在的淋巴细胞和单核细胞浸润及纤维化,比高脂饲料喂养合并STZ注射模型肾损伤程度更加严重。通过比较轻度、重度两种糖尿病肾损伤模型发现ETFβ只在重度肾损伤模型中表达下降。(2)在自发性2型糖尿病OLETF大鼠模型中,36周龄OLETF大鼠出现少量蛋白尿和轻度肾损伤,发展至56周龄时模型组大鼠出现大量尿蛋白,肾脏病理损害进一步加重,出现广泛的肾小管萎缩和间质纤维化,ETFβ只在56周龄重度糖尿病肾损伤大鼠肾组织中表达下降。2重度糖尿病肾损伤大鼠肾小管凋亡机制TUNEL法检测发现36周龄OLETF大鼠肾小管细胞很少凋亡,56周龄OLETF大鼠肾小管上皮细胞过度凋亡,同时Cleaved caspase-3的表达也只在56周龄OLETF大鼠肾皮质升高,进一步检测发现56周龄OLETF大鼠肾皮质中胞浆细胞色素C及BAX表达升高,Bcl-2表达下降；此外,肾组织NOX4的表达升高。3 ETFβ减轻脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡及其机制ETFp敲降对脂肪酸诱导的NRK 52E细胞凋亡的影响：将设计的三对siRNA序列分别转染至NRK 52E细胞中,通过Western blot实验筛选出敲除率达90%的一条siRNA序列,用于进一步研究。脂肪酸刺激肾小管上皮细胞的实验结果显示：05mMPA刺激NRK 52E细胞24h后,ROS生成增加,线粒体膜电位下降,BAX的表达升高,而Bcl-2表达下降,Cleaved caspase-3升高,流式及TUNEL均检测到细胞大量凋亡。ETFβ基因被敲除后,以上线粒体凋亡通路中指标的改变及细胞凋亡率均在PA刺激的基础上进一步加重,初步推测ETFβ的低表达促进了PA诱导的线粒体凋亡通路的激活。此外,ETFp过表达对脂肪酸诱导的NRK 52E细胞凋亡的影响显示：酶切和测序结果均显示ETFβ过表达重组质粒序列正确,将构建好的重组质粒转染至NRK52E细胞后发现融合蛋白在细胞中能成功表达。与PA刺激NRK 52E对照组相比,ETFp高表达组线粒体膜电位有所回升,ROS的量和BAX表达均有所降低,Bcl-2的表达升高,Cleaved caspas-3表达下降,细胞凋亡率有所下降,过表达的结果证实了ETFp基因有减轻脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用。结论：ETFp的表达随着糖尿病肾损伤进展在肾脏出现明显下降,提示ETFp参与糖尿病肾病进展。糖尿病肾病后期肾小管上皮细胞过度凋亡,胞浆细胞色素C表达升高等分子学改变显示线粒体凋亡通路激活参与糖尿病肾病肾小管凋亡。此外,脂肪酸刺激可引起NRK 52E细胞ETFβ表达明显下降,同时伴随着细胞线粒体凋亡通路激活及细胞凋亡率的显著升高；在此基础上降低细胞ETFβ表达后可以进一步促进细胞凋亡；而过表达ETFβ可部分逆转PA诱导的线粒体凋亡。由此我们推测ETFβ的下调可能参与了糖尿病肾病肾小管上皮细胞的凋亡过程,同时ETFp高表达可能减少糖尿病肾病脂肪酸诱导的肾小管凋亡,从而减轻糖尿病肾病进展。