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目的：清肝化瘀方是姚树坤教授根据其三十余年临床经验创制的治疗原发性肝癌的有效经验方,该方具有清热解毒,健脾祛湿,活血化瘀,软坚消癥等功效。前期临床研究显示,清肝化瘀方能够提高患者免疫功能,延长生存期,改善生活质量,可应用于大多数原发性肝癌患者,具有极高的开发研究价值。清肝化瘀颗粒是通过优化清肝化瘀方的制剂工艺而制成的颗粒剂。因此,本研究目的是评价清肝化瘀颗粒对二乙基亚硝胺(Diethylinitrosamine, DEN)致大鼠原发性肝癌的治疗效果,并通过RafMEK/ERK通路和PI3K/Akt信号通路初步探讨其分子作用机制。方法：SPF级健康雄性Wastar大鼠94只(体重190-210g),适应性饲养1周后,随机分为空白组(n=10)、模型组(n=20)、清肝化瘀颗粒低剂量组(n=16)、清肝化瘀颗粒中剂量组(n=16)、清肝化瘀颗粒高剂量组(n=16)、去甲斑蝥素组(n=16)。除空白组外,其余各组大鼠均进行腹腔注射DEN造肝癌模型。清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组大鼠每天灌胃颗粒剂量分别为0.6g/Kg、1.2g/Kg、2.4g/Kg;去甲斑蝥素组大鼠每天灌胃去甲斑蝥素片剂量为3mg/Kg；空白组及模型组大鼠每天灌胃等体积生理盐水,各组灌胃体积均为15m1/Kg。第16周末次灌胃给药后禁食12小时,麻醉大鼠腹主动脉取血,处死大鼠取肝脏、脾脏并称重。检测指标包括：各组大鼠死亡率、肿瘤发生率、肝脏湿重、肝脏指数、脾脏湿重、脾脏指数；ALT, AST, GGT, ALP, AFU, TBA, IL-6, IL-10,IL-17等血清生化指标；外周血T淋巴细胞亚群；免疫组化法及Western blot法检测肿瘤组织中p-Akt、p-MEK、p-ERK、VEGF的表达；RT-PCR检测检肿瘤组织中AktmRNA、 RKIP mRNA、PTEN mRNA的表达水平。结果：1清肝化瘀颗粒对DEN致大鼠原发性肝癌的抑制作用1.1清肝化瘀颗粒对肝癌大鼠生存率、肿瘤发生率、大鼠体重、肝脾指数的作用①大鼠生存率：模型组大鼠生存率为65%,清肝化瘀颗粒中剂量组大鼠生存率为100%,差异有统计学意义(p<0.05)。②肿瘤发生率：模型组肿瘤发生率为100%,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组肿瘤发生率分别为100%、87.5%、100%,去甲斑蝥素组肿瘤发生率为93.8%,各组差异无统计学意义(p>0.05)。③大鼠体重：与模型组相比,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组及去甲斑蝥素组大鼠体重均显著增加(p<0.01)。④肝脏指数、脾脏指数：与模型组比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组肝脏指数和脾脏指数均显著降低(P<0.01),去甲斑蝥素组肝脏指数亦显著降低(P<0.05)。1.2清肝化瘀颗粒对肝癌大鼠肝脏功能的改善作用与空白组相比,模型组大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP、AFU、TBA显著升高(p<0.01)。与模型组相比,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组及去甲斑蝥素组均可显著下调ALT、AST、GGT、ALP、AFU的表达水平(p<0.01)；清肝化瘀颗粒中、高剂量组及去甲斑蝥素组还可显著下调TBA的表达水平(p<0.01或p<0.05)。并且清肝化瘀颗粒中剂量组对上述指标的改善作用显著优于去甲斑蝥素组(p<0.01或p<0.05)。1.3清肝化瘀颗粒对肝癌大鼠外周血T淋巴细胞亚群及IL-6、IL-10、IL-17的作用与模型组相比,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组均可显著上调大鼠外周血CD4+细胞数(p<0.01或p<0.05)；清肝化瘀颗粒中、高剂量组还可显著上调CD4+/CD8+比值(p<0.01或p<0.05)。与空白组相比,模型组大鼠血清IL-6、IL-17显著降低(P<0.01)。与模型组相比,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组及去甲斑蝥素组均可显著上调IL-6、IL-10的表达水平(P<0.01)；清肝化瘀颗粒中、高剂量组及去甲斑蝥素组还可显著上调IL-17的表达水平；并且清肝化瘀颗粒中、高剂量组对IL-6、IL-17上调作用显著优于去甲斑蝥素组(p<0.01或p<0.05)。2清肝化瘀颗粒作用的分子机制初探2.1清肝化瘀颗粒对Raf/MEK/ERK信号通路的作用通过免疫组化法和Western blot法检测发现：与模型组相比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组中p-MEK、p-ERK的表达均显著降低(P<0.01或P<0.05)。RT-PCR检测发现：与模型组相比,清肝化瘀颗粒中剂量组RKIPmRNA的表达显著升高(P<0.05)。提示清肝化瘀颗粒可能具有抑制Raf/MEK/ERK信号通路的作用。2.2清肝化瘀颗粒对PI3K/Akt信号通路的作用通过免疫组化法和Western blot法检发现：与模型组相比,清肝化瘀颗粒低、中、高剂量组中p-Akt的表达显著降低(P<0.01或P<0.05)。RT-PCR检测发现：与模型组相比,清肝化瘀颗粒中、高剂量组PTEN mRNA的表达显著升高(P<0.01)。提示清肝化瘀颗粒可能具有抑制R af/MEK/ERK信号通路的作用。结论：1.清肝化瘀颗粒对DEN致大鼠原发性肝癌有显著抑制作用。2.清肝化瘀颗粒可能具有增强肝癌大鼠免疫功能的作用。3.清肝化瘀颗粒可能是通过抑制Raf/MEk/ERK 和 PI3K/Akt信号通路,发挥抗肿癌作用。4.清肝化瘀颗粒具有潜在临床意义和开发研究价值。