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角蛋白是一种结构稳定的硬质蛋白,不易被盐溶液、稀酸和稀碱降解。家禽羽毛中含有80%以上的角蛋白。大量的废弃羽毛造成环境污染,同时导致资源严重浪费,其综合利用,不仅可以解决饲料蛋白的紧缺,而且可以减少环境污染。本文以羽毛为唯一碳氮源选育高产角蛋白酶菌株,并对其发酵工艺条件优化,对酶进行分离纯化,研究角蛋白酶的酶学性质和在羽毛降解上的应用。其主要研究内容如下:(1)从养鸡场取得腐烂羽毛和土壤样品,以羽毛为唯一碳氮源筛选到一株高产角蛋白酶的菌株:CJPE209,该菌被鉴定为Bacillus sp.(芽孢杆菌属),保藏号为:CCTCC M 2015734。(2)采用单因素试验确定了Bacillus sp.CJPE209产角蛋白酶的发酵条件:发酵时间48 h,发酵温度37℃,接种量2%,摇床转速220 r/min,培养基装液量25mL/250 mL,初始pH 7。通过PB设计和CCD设计进一步优化培养基组分,得到的最佳培养基是:蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氢钾0.4 g/L、硫酸镁1.44 g/L、氯化钙1.1 g/L和氯化钠5 g/L。在最佳培养条件和最佳培养基组分的条件下,发酵液的酶活达到503.5 U/mL,是优化前的1.88倍。(3)对Bacillus sp.CJPE209所产的角蛋白酶通过硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶过滤脱盐、DEAE cellulose DE-52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析等一系列分离纯化的过程,得到纯的角蛋白酶,所得角蛋白酶比酶活为8527.19U/mL,纯化倍数为4.59倍,收率为12.35%。通过SDS-PAGE确定该角蛋白酶的分子量为43 kDa。通过试验确定该角蛋白酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH=8,在中性偏碱性环境下能保持较好的稳定性。同时研究金属离子和化学试剂对角蛋白酶酶活的影响和角蛋白酶的动力学参数。(4)通过粗酶液对羽毛的降解试验,确定Bacillus sp.CJPE209所产酶有降解羽毛的能力,粗酶液在48 h内可以使羽毛降解掉一半,同时产生可溶性氨基氮。可以将降解产物作为饲料添加剂用于动物饲料。