紫花苜蓿(Medicago sativa.L)是全世界范围内广泛种植的多年生优质豆科牧草,能够与土壤中的根瘤菌共生提高其抗逆性。由于紫花苜蓿种植范围广、营养价值高、适口性好,因而被称为“牧草之王”。虽然紫花苜蓿本身具有较强的抗逆性,但是恶劣的环境因素例如干旱、盐、低温、高温和病虫害等还是会引起紫花苜蓿的产量和品质严重下降。随着分子生物学的发展,利用转基因技术对紫花苜蓿进行遗传改良已被广泛应用。水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是负责植物体内水分转运的膜通道蛋白,对植物体内水分平衡的维持非常重要,能够参与植物的多种生理过程。但是,很多AQPs在植物体内的具体功能并不清楚。本研究利用RACE技术克隆分离了紫花苜蓿的水通道蛋白基因MsPIP2;2的全长cDNA序列,并通过生物信息学相关的软件对其序列进行了分析。我们利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对MsPIP2;2基因的组织表达模式进行了分析,并对其蛋白进行了亚细胞定位分析。通过各种表达载体的构建和农杆菌介导的转基因技术获得了MsPIP2;2转基因拟南芥和紫花苜蓿阳性植株,并对其功能进行了详细研究。本研究主要研究结果如下:1.本研究通过RACE技术从紫花苜蓿中克隆得到了水通道蛋白MsPIP2;2基因的cDNA全长。通过对全长序列分析表明,MsPIP2;2基因的cDNA全长为1322 bp,其中开放阅读框大小为864 bp,编码287个氨基酸,GenBank数据库登录号为MK109796。通过氨基酸多序列比对表明,MsPIP2;2与其他豆科植物的PIP2;2蛋白同源性很高,具有相同的保守结构域(2个NPA motif和6个跨膜螺旋)。利用Neighbour-joining方法构建进化树分析表明,紫花苜蓿的MsPIP2;2蛋白与其他豆科植物的PIP2;2聚集在相同或相邻的分支上,且与蒺藜苜蓿的亲缘关系最近,说明了 MsPIP2;2蛋白在进化上的保守性。2.利用qRT-PCR技术分析了MsPIP2;2基因的组织表达模式,结果发现MsPIP2;2基因在紫花苜蓿的根和叶组织中都有表达,且二者的表达量没有明显差异。此外,通过分析MsPIP2;2基因在干旱、盐和ABA处理下的表达量发现,MsPIP2;2基因在干旱胁迫条件下的表达量没有明显变化,但在盐和ABA处理的条件下,MsPIP2;2基因在根和叶中都明显上调,说明盐和ABA能够诱导MsPIP2;2基因的表达。3.通过过表达载体pCAMBIA1300-MsPIP2;2-GFP的构建和农杆菌介导的转化对MsPIP2;2蛋白进行烟草叶片亚细胞定位分析,结果表明MsPIP2;2蛋白主要定位在细胞质膜上。4.通过蘸花法将MsPIP2;2基因转入野生型拟南芥,并成功获得了MsPIP2;2转基因拟南芥纯合子。通过对MsPIP2;2基因的功能研究发现,在盐胁迫条件下,该基因能够通过降低转基因植株的膜损伤和ROS的积累,提高抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性、脯氨酸的含量和最大光合效率Fv/Fm来调节生理生化过程;也可以通过促进转基因植物中Na+的外排和K+的保留来缓解盐毒害;此外,MsPIP2;2还可以通过调节内源胁迫响应基因的表达从而提高植物的耐盐性。5.通过在培养基中施加不同浓度的Ca2+和pH值发现,高浓度Ca2+(≥6mM)或低pH(≤5)可以增强MsPIP2;2转基因拟南芥的耐盐性,而在低浓度Ca2+(≤1.5 mM)或高pH(≥6.5)条件下,MsPIP2;2对转基因拟南芥的耐盐性影响不大。6.利用CRISPR/Cas9技术成功构建了MsPIP2;2基因敲除载体,并通过组织培养的方法获得了MsPIP2;2过表达和敲除转基因紫花苜蓿。MsPIP2;2过表达紫花苜蓿能够通过降低细胞膜损伤、增加脯氨酸和叶绿素的积累以及降低ROS积累造成的氧化损伤来提高转基因苜蓿的耐盐性。综上所述,本研究成功分离克隆了紫花苜蓿的水通道蛋白MsPIP2;2基因。MsPIP2;2基因的表达主要受盐和ABA的诱导,其蛋白主要定位在细胞质膜上。MsPIP2;2基因能够通过调节转基因植株中的抗氧化防御体系介导的活性氧清除、K、Na离子平衡和内源胁迫基因的表达提高转基因拟南芥的耐盐性。MsPIP2;2基因通过提高脯氨酸含量、降低膜损伤和ROS的积累等生理变化提高了转基因苜蓿的耐盐性。