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烟草青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传细菌性病害,是烟草的主要病害之一。培育抗病品种是防治植物病害最经济有效的途径,了解其抗病机理,传统育种和分子育种相结合,是培育抗病品种的基本保障。本实验室前期利用RNA-seq检测了烟草根系中对青枯菌侵染有表达响应的基因。本研究在此基础上,对其中两个青枯菌侵染响应基因NtWRKY41和NtWRKY70进行功能分析,以检验它们是否在青枯病抗性中发挥作用。主要结果如下:1.利用qRT-PCR证实了抗青枯病烟草品种D101根系中10个基因（包括NtWRKY41和NtWRKY70）在青枯菌侵染3 h后表达显著上调,与RNA-seq测序结果一致,说明了 RNA-seq结果的可靠性。2.利用Gateway技术构建了NtWRKY41和NtWRKY70的瞬时超表达载体,并转化感青枯病烟草品种长脖黄,以转化空载体的苗为对照。（1）电导率测定结果显示,转NtWRKY41和NtWRKY70的烟苗叶片电导率分别在转化48 h和24 h后开始逐步上升,且显著高于对照,说明两个基因瞬时超表达成功。（2）对转化12 h、24 h和36 h的烟苗叶片进行qRT-PCR检测,结果显示,两基因表达量皆呈逐步上升趋势,且与对照差异极显著,进一步证实两个基因得到了瞬时超表达。（3）DAB染色结果显示,两基因瞬时超表达皆引起了烟苗叶片过氧化氢的少量积累,其中NtWRKY70超表达苗比NtWRKY41超表达苗积累量更多。（4）Trypan blue染色结果显示,两基因瞬时超表达皆引起烟苗叶片上少量细胞的死亡,其中NtWRKY70超表达苗比NtWRKY41超表达苗细胞死亡数量更多,叶片出现了黄化现象。（5）对转化14 d的烟苗进行青枯菌接种试验,结果两基因超表达烟苗的青枯病抗性均高于对照,其中NtWRKY41基因的抗病效应更为明显。3.利用Gateway技术构建了NtWRKY41和NtWRKY70病毒诱导的基因沉默载体,并转化D101,以转化空载体的苗为对照。（1）qRT-PCR分析结果显示,两基因在转化烟苗中的表达水平均低于对照,说明基因沉默成功。（2）转化14 d后青枯菌接种试验显示,两种基因沉默烟苗的抗病性皆明显低于对照,其中NtWRKY41基因沉默烟苗的抗性更弱,说明其抗性效应更大。4.利用Gateway技术构建了NtWRKY41和NtWRKY70的蛋白组亚细胞定位载体,并转化本氏烟草。激光共聚焦显微镜观察表明,NtWRKY41只分布在细胞核中,而NtWRKY70除了主要分布在细胞核中之外,还有少量分布在细胞膜上。5.通过CRISPR/Cas9技术构建了NtWRKY41基因敲除载体,并转入到D101中,获得13株阳性转基因苗。测序结果表明,有10株为NtWRKY41突变体,其中5株纯合,5株杂合。6.构建了 35S强启动子的NtWRKY41基因过量表达载体,并转入长脖黄中,获得了 24株转基因苗。卡那霉素检测和qRT-PCR检测结果显示,11株为阳性苗,其NtWRKY41基因的表达水平均高于对照。目前已收获T1代的种子。总之,本研究初步证明了NtWRKY41和NtWRKY70基因对烟草青枯病抗性皆有作用,其中NtWRKY41效应更大,为后续深入研究奠定了基础。