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胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GISTs)是一类最常见的胃肠道间叶源性肿瘤,不同危险度分层GISTs患者之间的远期疗效存在显著的差别。我们前期选取经危险度分层胃肠道间质瘤GISTs(即高危型和低危型)且免疫表型KIT阳性的GISTs组织为对象,发现并鉴定出Prohibitin(PHB)在高危型GISTs中表达明显上调。本部分将通过慢病毒介导的RNA干扰抑制胃肠道间质瘤GIST-T1中PHB表达,观察PHB基因沉默后对GIST-T1细胞体内外增殖能力的影响,探讨PHB在细胞内的亚细胞器定位介导的分子机制,为治疗胃肠道间质瘤奠定新的靶标基础。第一部分采用蛋白免疫印迹Western-Blot和实时定量PCR技术筛选抑制PHB效果达50%以上的有效片段,建立沉默PHB的稳转细胞株;通过细胞免疫荧光和线粒体分离试剂盒鉴定PHB在细胞内亚细胞器定位。结果显示shPHB-1、shPHB-4序列能够有效稳定沉默PHB基因,抑制效果达50%以上,并经过反复传代证实;细胞免疫荧光和线粒体提取并经过Western-blot验证PHB主要定位于线粒体中,只有微量的PHB定位于细胞核中。第二部分通过建立体外细胞模型和裸鼠体内荷瘤实验研究抑制PHB表达对胃肠道间质瘤GIST-T1的增殖生物学行为。体外实验,利用CCK8观察沉默PHB对胃肠道间质瘤的生长影响,并通过平板克隆和软琼脂集落形成实验来评价单细胞形成集落能力;体内实验,通过裸鼠皮下成瘤实验来进一步研究抑制PHB的表达对胃肠道间质瘤GIST-T1瘤体形成和生长的影响。体外CCK8实验显示沉默组shPHB-1、shPHB-4 GIST-T1细胞增殖能力减弱,平板克隆形成和软琼脂集落形成能力明显降低;体内裸鼠成瘤实验结果表面下调PHB表达水平后,裸鼠腋下种植瘤生长速度减慢,细胞成瘤能力降低。第三部分在线粒体结构方面,利用共聚焦和电子透射显微镜观察沉默PHB后细胞内线粒体的结构变化,并检测线粒体融合蛋白OPA-1的表达情况;在线粒体功能方面,通过检测线粒体膜电位的变化,呼吸链上ComplexI的活性,验证线粒体结构的变化是否对功能产生影响。并进一步了解膜电位和呼吸链的异常对活性氧ROS和能量ATP产生是否有影响。结果表明沉默PHB后丝网状的线粒体结构变为点、片状化,透射电镜显示线粒体肿胀、变圆,嵴变短变少,甚至线粒体转化为小空泡状结构。线粒体结构紊乱可能跟细胞缺失PHB后加强L-OPA-1酶解有一定关联。线粒体功能方面表明PHB蛋白功能减退时,可导致线粒体膜电位下降,线粒体呼吸链复合体Complex I活性水平降低,影响氧化呼吸链的正确装配,电子漏出形成活性氧ROS水平升高,但能量ATP变化差别不大。