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仔猪在断奶过程中肠道发生了显著的氧化应激,这是导致肠屏障损伤的重要原因,如何缓解断奶仔猪氧化应激已成为学术界和产业界共同关注的焦点。能量对肠上皮细胞更新和正常功能的发挥至关重要,而能量产生过程中伴随着线粒体的氧化呼吸链活性氧（ROS）的产生。线粒体作为细胞能量工厂,不仅是活性氧产生的主要场所,而且也是活性氧攻击的重要靶点。为了使细胞免受氧化损伤,细胞形成了 一种精细的自我保护机制,即在功能损伤的线粒体诱发细胞死亡之前选择性降解受损线粒体,被称为线粒体自噬。但是,迄今为止,国内外均未见关于线粒体自噬在氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤修复中的作用及其调控机制方面的研究报道。姜黄素是一种从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种天然酚类色素,是一种天然的抗氧化剂。本论文旨在探索仔猪氧化应激中线粒体自噬的作用及姜黄素的调控机制,为仔猪肠屏障损伤修复的营养调控研究提供崭新的思路和方向,具有重要的理论意义和应用价值。1.断奶应激对仔猪肠屏障、氧化平衡、线粒体功能和线粒体自噬的影响本试验研究了断奶后1周内仔猪肠道氧化平衡状态、肠屏障功能、线粒体功能和线粒体自噬水平的变化。选取杜×长×大三元杂交仔猪,分别于断奶后0天、1天、3天、7天屠宰取样,每次6头。氧化平衡状态通过抗氧化酶活性、抗氧化相关基因表达和空肠中丙二醛（MDA）含量进行测定;利用Ussing Chamber和空肠中紧密连接蛋白的表达和分布评估肠道屏障功能;利用线粒体DNA（mtDNA）含量、线粒体氧化磷酸化复合物的活性来表征肠道线粒体功能。通过测定线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）、LC3-Ⅱ、PTEN诱导激酶1（PINK1）和Parkin的表达水平,来探究线粒体自噬是否参与调控断奶应激。结果表明:（1）与断奶前相比,断奶后3天和7天超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及GPX-1、GPX-4的表达水平显著降低（P<0.05）,而空肠MDA含量显著提高,且断奶后3天Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达水平显著降低（P<0.05）。（2）断奶后3、7天,猪空肠上皮细胞跨膜电阻及紧密连接蛋白occludin、claudin-1和zonulaoccludens-1的表达显著降低,而异硫氰酸荧光素葡聚糖4kDa（FD4）通透性显著升高（P<0.05）。（3）断奶后3天和7天,肠道线粒体DNA含量和空肠线粒体复合体（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）活性显著下降（P<0.05）。（4）断奶后3天和7天,肠道线粒体中线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的表达水平显著升高（P<0.05）;断奶后1天、3天和7天空肠中,LC3-II与LC3-I含量的比值也显著增加（P<0.05）。（5）断奶后1天、3天和7天仔猪空肠粘膜中磷酸化AMP依赖的蛋白激酶/AMP依赖的蛋白激酶（pAMPK/AMPK）的表达显著增加（P<0.05）。结果提示,断奶会破坏肠道氧化平衡,损害肠屏障和线粒体功能,引发了线粒体自噬,激活了 AMPK信号通路。2.氧化应激对仔猪肠屏障、线粒体功能及线粒体自噬的影响本试验研究了氧化应激对仔猪肠屏障,线粒体功能和线粒体自噬水平的影响。选用12头35日龄健康杜×长×大断奶仔猪（平均体重为9.6 kg）,随机分成两个组:对照组,氧化应激组。每组6个重复,每个重复1头仔猪。氧化应激组的猪注射10 mg/kgdiquat,对照组的仔猪注射等量的0.9%（w/v）NaCl溶液。结果表明:（1）氧化应激显著降低了仔猪平均日采食量和平均日增重（P<0.05）,显著抑制了空肠中SOD和GSH-Px的活性（P<0.05）,显著提高了空肠MDA含量（P<0.05）。（2）氧化应激显著降低了猪空肠上皮细胞跨膜电阻（TER）与紧密连接蛋白（Claudin-1、occludin、ZO-1）的表达（P<0.05）,显著提高空肠FD4的通透性（P<0.05）。（3）氧化应激导致仔猪空肠线粒体形态发生明显的肿胀、空泡化、基质皱缩明显,线粒体嵴数减少或断裂;Diquat显著提高了肠道线粒体活性氧产量（P<0.05）,显著降低了肠道线粒体膜电位（P<0.05）,这说明了氧化应激导致线粒体功能障碍（P<0.05）。（4）氧化应激显著降低了线粒体生物发生和功能相关的基因,过氧化物酶体增殖物激活的受体-g共激活子-1α（PGC-1α）、哺乳动物沉默信息调节蛋白-1（SIRT-1）、核呼吸因子-1（NRF-1）、线粒体转录因子A（TFAM）、线粒体单链DNA结合蛋白（mtSSB）、线粒体聚合酶r（mtpolr）、葡萄糖激酶（glucokinase）、柠檬酸合酶（CS）、三磷酸腺苷合酶（ATPS）和细胞色素c氧化酶Ⅰ（CcOX Ⅰ）和Ⅴ在空肠中的表达（P<0.05）。（5）氧化应激显著提高了线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin在肠道线粒体中表达（P<0.05）,并且显著提高了空肠粘膜中LC3-II与LC3-I含量的比值（P<0.05）。（6）氧化应激显著增加pAMPK/AMPK的表达（P<0.05）。结果提示,氧化应激破坏肠道屏障,引起线粒体功能障碍,并触发了线粒体自噬,激活了 AMPK信号通路。3.AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激肠上皮细胞修复中的作用本试验旨在研究H2O2诱导的体外氧化应激模型对肠上皮细胞氧化平衡、肠上皮屏障功能和线粒体能量代谢的影响,明确AMPK-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤修复中的作用。利用H2O2诱导的肠上皮IPEC-J2细胞氧化应激模型,研究H2O2诱导的氧化应激对肠上皮细胞氧化平衡、肠上皮屏障功能、线粒体能量代谢、线粒体自噬和AMPK信号通路的影响及AMPK抑制剂Compound C和线粒体自噬抑制剂Mdivi-1的干预作用。结果表明:（1）与对照组相比,600 μM的H2O2处理显著提高了 p-AMPK的表达水平（P<0.05）。600 μM和800μM的H2O2处理显著提高了 PINK1、Parkin表达水平和LC3Ⅱ/1比例（P<0.05）,说明氧化应激激活了 AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬。（2）与对照组相比,氧化应激显著降低了肠上皮细胞SOD、CAT活性（P<0.05）,显著提高了 MDA含量（P<0.05）,同时显著降低了抗氧化应激相关基因的表达（P<0.05）。与氧化应激组相比,添加Compound C和Mdivi-1加剧了氧化应激。（3）与对照组相比,氧化应激组显著提高了线粒体活性氧含量（P<0.05）。与氧化应激组相比,CompoundC和Mdivi-1处理提高了线粒体活性氧含量（P<0.05）。（4）与对照组相比,氧化应激显著降低了肠上皮细胞TER和紧密连接蛋白的表达（P<0.05）,显著提高了 FD4通透性（P<0.05）。与氧化应激组相比,Compound C+ H2O2和Mdivi-1+H2O2处理显著降低了肠上皮细胞TER（P<0.05）。（5）与对照组相比,氧化应激显著降低了肠上皮细胞ATP产量、线粒体膜电位和线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性（P<0.05）。而与氧化应激组相比,Compound C和Mdivi-1处理加剧了氧化应激诱导的线粒体功能的紊乱。且氧化应激组、Compound C+H2O2 组、Mdivi-1+H2O2 组、Compound C+Mdivi-1+H2O2组均能观察到明显的线粒体肿胀、呼吸嵴断裂及线粒体空泡化的现象。（6）与对照组相比,氧化应激组、Compound C+H2O2组、Mdivi-1+H2O2组、Compound C+Mdivi-1+H2O2组均能观察到细胞整体耗氧量的降低。与氧化应激组相比,Compound C+Mdivi-1+H2O2处理显著降低了细胞的最大呼吸耗氧量和备用呼吸能力（P<0.05）。（7）与对照组相比,H2O2处理显著提高了PINK1、Parkin、Beclin-1的表达量和LC3Ⅱ/Ⅰ表达量的比例（P<0.05）。与氧化应激组相比,Compound C和Mdivi-1处理显著抑制了氧化应激诱导的保护性线粒体自噬反应（P<0.05）。（8）与对照组相比,氧化应激组可以观察到损伤线粒体被双层膜自噬泡包裹的现象。与氧化应激组相比,Compound C+H2O2组中存在较少的线粒体自噬小体。而在Mdivi-1+H2O2组和Compound C+Mdivi-1+H2O2组中几乎未见线粒体自噬小体。（9）为了直接可视化IPEC-J2细胞内线粒体自噬的激活情况,本试验利用了 Ad-GFP-LC3和Ad-HBAD-Mito-dsred来实时监测IPEC-J2细胞中线粒体自噬体的形成。H2O2处理显著增加了 IPEC-J2细胞中两者的共定位,而 Compound C+H2O2 组、Mdivi-1+H2O2 和 Compound C+Mdivi-1+H2O2 组中共定位显著降低。结果提示:H2O2诱导的氧化应激模型会导致肠上皮屏障损伤、线粒体活性氧含量升高、线粒体空泡化和线粒体能量代谢紊乱;H2O2诱导的肠上皮细胞氧化应激会激活AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬;抑制AMPK信号通路和线粒体自噬加剧了 H2O2诱导的氧化应激、肠屏障损伤和线粒体能量代谢紊乱,明确了 AMPK信号通路和PINK1-Parkin介导的线粒体自噬在氧化应激诱导的肠道损伤中发挥重要的调控作用。4.基于AMPK-PINK1/Parkin通路研究姜黄素缓解氧化应激诱导的肠屏障损伤的机制肠上皮是抵御有害抗原和病原体最关键的屏障。氧化应激与肠屏障功能的障碍密切相关。姜黄素因其抗氧化应激功能而受到广泛关注,然而,姜黄素能否缓解由氧化应激引起的肠道损伤和线粒体损伤尚不清楚。本试验旨在探讨姜黄素是否可以通过保护线粒体功能,提高线粒体自噬水平来缓解氧化应激诱导的仔猪肠屏障损伤,并基于AMPK-PINK1/Parkin通路阐明姜黄素缓解氧化应激诱导的肠屏障损伤的机制。本试验通过腹腔注射diquat建立仔猪氧化应激模型,发现在其日粮中添加姜黄素可以保护肠道屏障功能,改善氧化还原状态,减轻线粒体损伤,触发线粒体自噬并影响AMPK-TFEB信号通路。进一步利用体外氧化应激模型发现姜黄素能够以PINK1-Parkin-线粒体自噬依赖的方式,有效缓解H2O2诱导的IPEC-J2细胞的氧化应激。进一步研究其分子机制,本试验发现干扰Parkin破坏了姜黄素对IPEC-J2的抗氧化应激作用,抑制了姜黄素对H2O2诱导的IPEC-J2细胞的肠屏障和线粒体功能的保护作用。在转染GFP-ParkinΔUBL（编码E3泛素连接酶活性的突变型Parkin蛋白）的细胞中,姜黄素的保护作用被抑制,这表明姜黄素的保护作用需要Parkin的E3泛素连接酶活性。另一方面,本试验还发现干扰PRKAA1后,姜黄素对H2O2处理的IPEC-J2细胞的保护功能减弱。免疫荧光和荧光素酶实验表明,姜黄素显著增强了 H2O2处理的IPEC-J2细胞中TFEB的核转运和转录活性,但是该作用被Compound C所抑制,这表明姜黄素通过AMPK信号通路促进TFEB转录。综上所述,这些结果揭示了姜黄素通过激活AMPK诱导Parkin依赖的线粒体自噬核TFEB核易位,从而改善氧化应激,增强肠屏障功能和线粒体功能。综上所述,断奶会破坏肠道氧化平衡,导致肠道发生氧化应激,断奶和氧化应激均会导致肠道屏障功能的损伤以及线粒体功能紊乱,而且会激活肠道线粒体自噬和AMPK,说明线粒体自噬和AMPK可能参与了断奶应激和氧化应激后肠屏障损伤修复过程。而且在体外氧化应激模型中同时抑制AMPK信号通路和线粒体自噬加剧了 H2O2诱导的氧化应激、肠屏障损伤和线粒体能量代谢紊乱,明确了 AMPK信号通路和线粒体自噬在氧化应激诱导的肠道损伤中发挥重要的调控作用。阐明了姜黄素是通过AMPK-TFEB信号通路调控Parkin的E3泛素连接酶介导的线粒体自噬进而缓解了氧化应激诱导的肠屏障损伤和线粒体功能损伤。