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目的:肺孢子菌肺炎(Pneunocystis pneumonia,PCP),是由机会性致病真菌——肺孢子菌(Pneumocystis,Pc)所引起的一种感染性疾病,最常发生于肺部,严重可致死。PCP最开始引起人们的关注是由于研究揭示了它与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染密切相关,特别在1981年将PCP定义为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的标志性疾病;近年来的流行病学资料显示,随着器官移植、恶性肿瘤、长期应用激素等非HIV感染的免疫功能抑制患者增多,在这类患者中并发PCP的临床病例不断上升,PCP再次引起了国内外研究者的极大关注。目前PCP临床治疗主要以复方磺胺甲基异恶唑为主,虽然能够取得一定的疗效,但因其毒副作用较大,造成部分患者不能耐受,加之出现的耐药性等问题,药物防治PCP面临严峻挑战。于是,国内外研究者纷纷将注意力转移到针对PCP的新防治策略及相关疫苗的开发上。先前有研究发现,作为Pc抗原成分之一的P55蛋白,在抗PCP中具有重要作用。机体主动免疫天然P55蛋白后,产生的免疫反应可以使机体在感染的初期得到一定程度的保护,故有研究者认为P55蛋白最有希望成为抗PCP的候选疫苗之一。然而,由于P55蛋白存在5种变异体,再加上到目前为止Pc在体外很难培养出足够的数量用于抗原制备,以致抗原的来源受阻,造成P55蛋白疫苗的开发一直没有取得有效进展。基于上述原因,本课题组利用生物信息学和分子生物学技术,人工设计构建了包括5种变异体有效抗原表位在内的p55多表位串联基因(p55TAG),并在前期研究中用原核表达载体及真核表达载体验证出p55TAG能有效表达出目的抗原蛋白,且该基因的分子疫苗在免疫抑制的大鼠PCP模型中具有一定的免疫保护潜力。但因Pc作为一种机会性感染真菌,主要侵犯免疫功能低下患者,对于这类人群采用常规单一的分子疫苗往往难以达到预期的免疫效果,于是课题组提出采用异质性“初次-加强免疫策略”(prime-booststrategy),即用两种异质的分子疫苗进行免疫,以提高疫苗抗PCP的效果。根据上述构想,本研究计划首先利用腺病毒载体搭载p55TAG构建一个重组腺病毒载体疫苗;其次验证其在真核细胞HEK293中的蛋白表达情况;最后用包装好的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内相关免疫指标,以分析构建疫苗的免疫原性。期望能为抗PCP感染的异质性“初次-加强免疫策略”提供一种具有“加强免疫”作用的制剂,为最终建立有效的抗PCP疫苗奠定前期实验基础。研究方法:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增用BglⅡ和XhoⅠ双酶切pMD18-T克隆载体上p55TAG目的基因,产物测序鉴定;PCR扩增鉴定正确的目的基因,产物胶回收。2.p55TAG重组腺病毒载体构建经EcoRI酶切的腺病毒连接质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP与p55TAG目的基因进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,PCR扩增Amp+LB培养基上的单克隆菌落,产物测序鉴定。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装将重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染进HEK293细胞后观察GFP表达及CPE改变,包装后的重组腺病毒命名为pHBAd-p55TAG。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定及真核细胞中目的蛋白表达提取pHBAd-p55TAG核酸,PCR扩增后产物测序鉴定;对重组腺病毒在HEK293细胞内所表达的蛋白进行SDS-PAGE与Western blot鉴定。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验5.重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定用pHBAd-p55TAG反复感染HEK293细胞三次,收集最后一次的病毒液,CsCl梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定纯化后的病毒滴度。6.重组腺病毒载体疫苗免疫动物将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,按随机分组原则分为pHBAd-GFP、pHBAd-p55TAG、PBS三组,每组10只;腹腔单针免疫,注射量为50μl/只。7.重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验于免疫后的第3d、1w、2w、3w末采集小鼠血清,MSD法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子的水平;ELISA法检测3w末小鼠血清中IgG总抗体、IgG1和IgG2a抗体亚类的水平;流式细胞术对3w末小鼠脾细胞进行CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群分析,同时用qPCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子相对表达量变化。8.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差(X±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增结果从本室保存的载体上经酶切、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1200bp左右处出现特异条带(p55TAG基因片段全长1164bp),测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致。2.p55TAG重组腺病毒载体构建结果转化后,从Amp+LB平板挑选8个单克隆菌落,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,有6个转化子在1500bp处出现特异性条带,选取阳性PCR产物进行测序,测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致,证明重组腺病毒载体成功构建。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装结果重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,48h后观察到GFP明显表达,证明转染成功;8d后细胞出现典型CPE现象,证明重组腺病毒包装成功。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定结果PCR扩增pHBAd-p55TAG,产物电泳后在1500bp出现特异性条带,测序结果与原始p55TAG目的基因序列比对结果一致,证明包装出的腺病毒中携带有p55TAG目的基因。5.p55TAG重组腺病毒在HEK293细胞中蛋白表达结果Western blot显示:与空载病毒相比,重组腺病毒在60kDa处有一明显条带,与预期结果相符,证明pHBAd-p55TAG在HEK293细胞中成功表达出目的蛋白。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验6.重组腺病毒的扩增、纯化后滴度测定结果pHBAd-p55TAG扩增三代,纯化后的病毒采用TCID50法测定的病毒滴度为1.99×1010PFU/ml,可用于下一步动物免疫实验。7.鼠脾CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群流式分析结果流式细胞术分析3w末小鼠脾T淋巴细胞,统计学分析结果显示;pHBAd-p55TAG组的CD4+T淋巴细胞升高水平相较于pHBAd-GFP和PBS组具有统计学意义(P<0.05;P<0.01);而在各组CD8+T淋巴细胞水平比较中,pHBAd-p55TAG组CD8+T淋巴细胞升高水平相较于PBS组具有统计学意义(P<0.05)。8.鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平分析结果MSD法检测鼠血清中四种细胞因子的浓度随时间变化水平,统计学分析结果显示:pHBAd-p55TAG组细胞因子IFN-γ和IL-17浓度升高水平相比其他两组具有统计学差异(P<0.01);而IL-2和IL-4的变化则不具有统计学意义(P>0.05)。9.鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平分析结果ELISA法检测3w末鼠血清中IgG抗体和IgG2a亚类的变化水平,与其他两组相比,pHBAd-p55TAG组显著升高(P<0.01),而抗体IgG1亚类在三组之间的变化水平无统计学意义(P>0.05);计算三组IgG2a与IgG1比值,进行统计学分析结果显示pHBAd-p55TAG组与其他两组比较具有统计学差异(P<0.05)。10.鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组相比PBS组四种细胞因子的表达量均有所升高,pHBAd-p55TAG组相较于PBS组,除IL-4外,其余三种细胞因子的升高水平都具有不同程度的统计学差异,其中IL-17的升高具有极显著差异(P<0.001);在pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组的统计学比较中,只有IL-17的升高水平具有统计学意义(P<0.001)。结论:1.本研究成功构建出p55多表位串联基因腺病毒载体;2.包装后的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗,可在真核细胞HEK293中成功表达出目的蛋白;3.构建的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱发小鼠体内细胞和体液免疫反应,验证其具有一定的免疫原性,为进一步抗肺孢子菌感染新策略、新疫苗研究奠定了实验基础。