研究背景和目的:心肌肥厚(Cardiomyocytes hypertrophy)以心肌细胞肥大为主要特征,是心力衰竭发生发展的重要病理过程。心力衰竭是一种高发病率,高死亡率的临床疾病,近年来呈现出年轻化趋势,给社会带来巨大的经济和精神压力。心力衰竭相关的分子机制一直是研究的热点,但其具体的潜在分子机制尚不明确。已有研究证实:尼古丁是导致心肌肥厚的重要危险因素。但尼古丁如何诱导心肌肥厚的发生,其作用机制尚不明确。自噬(Autophagy)是细胞通过形成双层膜包被的自噬小体,包被受损的细胞器或者错误折叠的异常蛋白形成自噬小体,与溶酶体融合成为自噬溶酶体后,将包被物降解,以清除有害物质,同时实现物质的循环利用,维持细胞正常代谢的过程,其在心肌肥厚的发生发展中发挥重要作用。完整的自噬流是细胞维持正常功能的必备条件。组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是心肌细胞溶酶体内降解底物最主要的酶,在自噬流的后期发挥关键作用。西洛他唑(Cilostazol),通过抑制PDEs活性,具有扩张血管和抗血小板的作用,临床主要用于治疗周围血管疾病。有研究证明:西洛他唑可以通过调控自噬治疗帕金森疾病。因此,在本研究应用西洛他唑预处理心肌细胞,观察其对CTSB酶活性,尼古丁诱导自噬流损伤以及心肌肥厚的影响。那么尼古丁阻断自噬流是否与CTSB酶活性相关?多项研究表明:氧化应激参与心肌肥厚的发生和发展,活性氧(reactive oxygen species,ROS)作为主要的氧化中间产物在该过程中发挥关键作用。而p38MAPK/JNK是ROS的下游分子,ROS堆积会激活p38MAPK/JNK。已证实:JNK的激活与自噬流阻断相关。由此我们猜测:尼古丁阻断自噬流是否通过ROS/p38MAPK/JNK信号通路,进而诱导心肌肥厚的呢?据上述背景,本论文旨在探究尼古丁通过调控自噬诱导心肌肥厚的作用及潜在的分子机制,为临床预防和治疗心衰及心肌肥厚提供新思路和潜在靶点。研究内容:1.尼古丁损伤自噬流,诱导心肌肥厚。2.尼古丁通过抑制CTSB酶活性阻断自噬流。3.尼古丁诱导自噬流损伤与ROS/p38MAPK/JNK信号轴相关。4.尼古丁通过CTSB/ROS/p38MAPK/JNK反馈环调控自噬流,参与心肌肥厚。研究方法:本课题所用细胞为Wistar大乳鼠原代心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs)。1.Wistar 大乳鼠原代心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs)的提取[1]。2.尼古丁对于心肌肥厚的作用研究。(1)利用苏木精-伊红染色法检测心肌细胞表面积;(2)应用荧光定量聚合酶链反应技术(quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测尼古丁处理后心肌肥厚标志蛋白ANP,BNP及β-MHC mRNA水平的变化。3.自噬的检测自噬损伤是心肌肥厚发生的重要环节。因此,在明确尼古丁可以诱导心肌肥厚的基础上,我们研究了自噬在该过程中的作用。(1)透射电镜(transmission electron microscope TEM)检测尼古丁对心肌细胞内自噬小体和自噬溶酶体的影响;(2)应用western blot检测尼古丁对自噬相关蛋白及自噬小体标志蛋白的影响;(3)应用RFP-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞观察尼古丁处理后心肌细胞内自噬流的变化情况。(4)加入bafA1与尼古丁共处理,检测其对于自噬流的影响。4.尼古丁对溶酶体功能的作用。为了探究尼古丁诱导自噬流损伤是否通过影响溶酶体的功能,接下来我们检测了心肌细胞溶酶体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)酶活性的变化。(1)应用Magic Red组织蛋白酶活性试剂盒检测尼古丁处理后心肌细胞内CTSB的酶活性,即尼古丁对溶酶体功能的影响,同时设置巴弗洛霉素,雷帕霉素和PP242(mTOR抑制剂)作为阴性和阳性对照组。应用CTSB的激活剂西洛他唑预处理后,同样检测CTSB的活性;(2)应用qRT-PCR技术检测尼古丁是否通过干扰CTSB mRNA水平影响其酶活性;同时设置西洛他唑和巴弗洛霉素和/或尼古丁处理组;(3)应用western blot技术检测CTSB及其前体pro-CTSB蛋白水平的变化。5.CTSB酶活性与自噬流损伤和心肌肥厚的关系。(1)应用western blot技术检测西洛他唑预处理后自噬标志蛋白LC3 Ⅱ及底物p62的影响;(2)转染ADV-RFP-GFP-LC3观察西洛他唑对自噬流的影响;(3)qRT-PCR技术检测西洛他唑对心肌肥厚标志蛋白mRNA水平的影响。6.细胞内氧化应激水平的动态平衡与自噬相关。(1)应用 2,7-dichlorofuorescin diacetate(DCFH-DA)探针标记心肌细胞,检测尼古丁对心肌细胞内活性氧水平的影响,设置NAC处理组作为阳性对照组;(2)为了进一步明确氧化应激在尼古丁诱导心肌肥厚中的作用,我们应用氧化应激的抑制剂NAC预处理后,应用western blot检测NAC对自噬标志蛋白的作用;(3)qRT-PCR技术检测NAC对心肌肥厚标志蛋白mRNA水平的影响;(4)ADV-RFP-GFP-LC3转染:检测应用西洛他唑预处理后对自噬流的影响。7.细胞内活性氧与MAPKs信号通路关系的检测。(1)Western blot技术检测尼古丁单独处理和尼古丁与p38MAPK抑制剂SB203580及JNK抑制剂SP600125共处理对对应信号分子及自噬标志蛋白的影响;(2)应用转染ADV-RFP-GFP-LC3心肌细胞观察尼古丁及通路抑制剂处理后自噬流的变化情况;(3)qRT-PCR技术检测抑制剂对尼古丁处理后心肌肥厚标志物的影响;(4)CTSB酶活性试剂盒检测抑制剂处理后CTSB酶活性的变化;(5)应用活性氧检测试剂盒检测抑制剂对心肌细胞内活性氧水平的影响。8.CTSB酶活性与ROS/p38MAPK/JNK通路的关系。为了明确CTSB酶活性在尼古丁诱导心肌肥厚中的作用,我们应用西洛他唑处理心肌细胞激活CTSB酶活性后,分别进行如下实验。(1)活性氧检测试剂盒检测心肌细胞内的ROS;(2)Western blot技术检测p38MAPK及JNK磷酸化水平的变化。实验结果:1.不同浓度(0,1,10,100,500 μ M)尼古丁处理后,能够显著诱导心肌肥厚。(1)HE染色结果表明,心肌细胞表面积较对照组显著增大(图1A)。(2)qRT-PCR结果显示心肌肥厚标志物ANP,BNP及β-MHC mRNA水平也显著升高。(图1B-D)2.尼古丁诱导心肌细胞自噬流损伤。(1)透射电镜结果表明尼古丁处理后,心肌细胞内自噬小体的数量明显增加(图2A)。不同浓度梯度尼古丁处理后,自噬相关蛋白LC3 Ⅱ和底物p62水平均显著升高,与巴弗洛霉素处理组相似,而雷帕霉素处理组中,LC3 Ⅱ表达量增高,而底物p62表达量下调(图2B)。(2)尼古丁和巴弗洛霉素共处理后,自噬流阻断较尼古丁单独处理组明显加重,但与巴弗洛霉素单独处理组相比无明显差异(图2C)。(3)RFP-GFP-LC3腺病毒转染后显微镜下可以看到心肌细胞中红色荧光和绿色荧光较空白对照组均增加,与巴弗洛霉素相似,雷帕霉素处理后则红光增多,绿光减弱(图3A)。(4)自噬溶酶体标志蛋白LAMP2蛋白水平下降,而溶酶体标志蛋白LAMP1无明显变化(图3B)。3.尼古丁抑制心肌细胞内组织蛋白酶B(CTSB)活性。PP242作为mTORC1抑制剂与雷帕霉素被设为阳性对照,巴弗洛霉素被设为阴性对照。(1)酶活性检测结果表明,不同浓度尼古丁处理后,CTSB酶活性呈浓度依赖性降低,与巴弗洛霉素处理后的变化一致;雷帕霉素与PP242处理均可以显著升高酶活性(图4A)。西洛他唑作为CTSB酶活性激活剂可以显著改善尼古丁诱导的CTSB酶活性的降低(图4B)。(2)qRT-PCR结果显示:尼古丁不影响CTSB mRNA水平,西洛他唑处理后也无明显变化(图4C)。(3)Western blot结果显示:尼古丁可以升高CTSB蛋白水平。同时,较高浓度尼古丁(100μM,500μ M)还可以升高CTSB前体蛋白水平(图4D-E)。4.西洛他唑通过激活CTSB酶活性调控自噬流,缓解心肌肥厚。(1)西洛他唑可以改善尼古丁诱导的自噬流阻断:LC3 Ⅱ及底物p62水平均下调(图5A)。(2)ADV-RFP-GFP-LC3转染结果显示,西洛他唑预处理后细胞内绿色荧光显著减弱(图5B)。(3)西洛他唑缓解尼古丁诱导的心肌肥厚。qRT-PCR结果显示,西洛他唑可以明显降低心肌肥厚标志蛋白的表达量(图6A-C),但只在较高浓度(500 μM)升高CTSB mRNA水平,在100 μM时无影响(图6D)。5.尼古丁诱导心肌细胞内活性氧的堆积。(1)不同浓度尼古丁处理后,心肌细胞内活性氧水平显著增高,活性氧清除剂NAC组为阳性对照(图7A)。(2)NAC处理能够降低心肌细胞中LC3 Ⅱ与p62表达量(图7B-D)。(3)qRT-PCR结果表明:NAC与尼古丁共处理组与单独尼古丁处理组相比,心肌肥厚标志物均明显下调(图7E)。6.活性氧堆积与MAPKs信号通路激活相关。(1)尼古丁可以激活心肌细胞内p38MAPK/JNK信号通路(图8A-C),NAC,SB203580(p38MAPK抑制剂)及SP600125(JNK抑制剂)则可以明显降低相应信号分子磷酸化水平,SB203580和SP600125能显著降低LC3 Ⅱ与p62水平(图 8D-F,9A-B)。(2)ADV-RFP-GFP-LC3转染:观察抑制剂处理后,心肌细胞内绿色荧光减弱(图 10A)。(3)SB203580 及 SP600125 可以明显降低 ANP,BNP,β-MHC mRNA 水平(图10B-C)。(4)NAC,SB203580及SP600125处理后,心肌细胞内ROS荧光强度明显降低(图 11)。7.CTSB酶活性与ROS/p38MAPK/JNK信号通路共同调控自噬,调节心肌肥厚。(1)NAC,SP600125和SB203580预处理均可明显改善尼古丁诱导的CTSB酶活性下降(图12)。(2)西洛他唑可以明显降低心肌细胞中ROS的堆积(图13)。(3)Western blot结果显示:西洛他唑可以降低p38MAPK/JNK的磷酸化水平(图14)。即:CTSB与ROS/p38MAPK/JNK轴形成反馈环共同调控自噬流,参与心肌肥厚。结论及意义:综合所有实验结果,我们首次发现尼古丁可以通过抑制CTSB酶活性阻断自噬流,诱导心肌肥厚。西洛他唑通过激活CTSB酶活性与抑制ROS/p38/JNK形成反馈环调控自噬,进而缓解尼古丁诱导的心肌肥厚(图15)。该研究结果将进一步完善尼古丁诱导心肌肥厚发病分子机制的理论体系,为心肌肥厚的临床治疗提供新的思路。