背景和研究目的:糖尿病(Diabetes)是一组以高血糖为特点的代谢性疾病[1],发病人数日益增多,对人类的医疗保健和社会经济发展产生了巨大的影响[2],迄今为止,暂没有疗效显著、无副作用的治疗糖尿病的药物。本论文从益生菌能够在肠道直接消耗葡萄糖的角度出发,探究了益生菌组合对糖尿病小鼠的治疗效果,并探讨其在治疗过程中的相关机制,为糖尿病的改善和治疗提供了新的依据。肠道益生菌在肠道内利用葡萄糖,加速人体内葡萄糖的代谢[3],糖尿病患者体内葡萄糖含量居高不下,在肠道益生菌的参与下,是否能降低体内葡萄糖的浓度?为了验证这一效果并探究其中相关的机制,本研究选用乳酸菌培养基(Lactobacilli MRS Broth,MRS)对实验室8株益生菌进行筛选,通过测定培养基中剩余葡萄糖的含量评价各益生菌的耗糖能力。选取其中耗糖能力较强的5株益生菌进行益生性质的检测,包括益生菌的耐酸、耐胆盐、抑菌、细胞黏附以及抑制致病菌黏附。动物实验选用链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠模型和糖水喂养诱导糖尿病小鼠模型,利用筛选出的5株益生菌组合进行治疗,结果表明,益生菌组合对两种糖尿病模型小鼠都有较好的治疗效果。方法一:STZ诱导糖尿病小鼠模型1.降糖菌株的筛选。挑选8株益生菌活化(巴马长双歧杆菌,鼠李糖乳杆菌,保加利亚乳杆菌,嗜酸乳杆菌,巴马动物双歧杆菌,植物乳杆菌,加氏乳杆菌和嗜热链球菌),按照1%的接种量接种于MRS中,分别在0、4、8、12、16、20、24 h检测培养基中剩余葡萄糖的含量,从中挑选出降糖能力高的益生菌;2.益生菌益生性质的检测。将挑选出的益生菌分别进行益生性质的检测,包括耐酸实验、耐胆盐实验、抗氧化性实验、抑菌实验、细胞黏附实验和抑制致病菌黏附实验;3.STZ诱导糖尿病小鼠模型的建立。采用8周龄雄性昆明小鼠,分为正常对照组(C组)、模型组(S组)、STZ+糖水喂养组(SG组)以及益生菌组合治疗组(SGP组),每组8只。腹腔注射STZ(40 mg/kg/天)持续5天构建糖尿病小鼠模型;4.糖尿病小鼠模型的治疗。造模确定成功后每天给予SGP组配制好的益生菌组合,总给药时长为7周;5.益生菌组合对STZ诱导的糖尿病小鼠的治疗效果及作用机制。通过每周测量每组小鼠的血糖及体重评价益生菌组合对糖尿病小鼠的治疗效果。检测到糖尿病小鼠在治疗后血糖得到明显改善时,进行糖耐量的实验观察小鼠机体对于葡萄糖的调控能力。应用Western blot,检测胰腺组织炎症信号通路(TLR-4、NF-κB/p-NF-KB)蛋白表达以及小肠组织屏障蛋白表达(ZO-1、Claudin 1)。采用q-PCR,检测小肠组织葡萄糖转运蛋白水平(SGLT-1、GLUT-2)以及胰腺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和PDX-1的表达。结合胰腺组织的免疫荧光切片分析各组小鼠的胰岛素表达情况。方法二:糖水喂养小鼠模型1.糖水喂养小鼠模型的建立。采用8周龄雄性昆明小鼠,分为正常对照组(C组)、模型组(G组)以及益生菌治疗组(GP),每组8只。每天给小鼠喂养5%的糖水构建高血糖小鼠模型;2.糖水喂养小鼠模型的治疗。每天给GP组小鼠灌胃109 CFU/100 μL益生菌组合;3.益生菌组合对糖水喂养小鼠的治疗效果及作用机制。通过每周对各组小鼠血糖、粪便葡萄糖浓度及体重的检测,评价益生菌组合对糖尿病小鼠的疗效。通过各组小鼠胰腺组织切片的免疫荧光,评价小鼠胰腺分泌胰岛素的能力。采用糖耐量实验,评价小鼠机体对葡萄糖浓度的调控能力。应用Western-blot,检测胰腺组织炎症信号通路(TLR-4、p-NF-κB/NF-1κB)蛋白表达及小肠组织肠道屏障蛋白(ZO-1、Claudin 1)表达。采用q-PCR,检测胰腺组织在转录水平炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达、PDX-1以及小肠组织葡萄糖转运蛋白(SGLT-1、GLUT-2)表达。结果一:STZ诱导糖尿病小鼠模型1.益生菌体外降糖实验的结果表明,巴马长双歧杆菌、巴马动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌消耗葡萄糖的能力最强;2.益生菌的体外益生性质实验结果表明,5种益生菌均具有较好的耐酸能力、耐胆盐能力、抑菌能力、黏附小肠细胞的能力以及抑制致病菌黏附细胞的能力;3.小鼠血糖和粪便葡萄糖浓度的结果显示,SG组血糖水平最高,而SGP组小鼠血糖水平得到了抑制;4.糖耐量实验结果表明,在经过几周的益生菌治疗后,SGP组小鼠在同样的时间内能较快的调节体内的葡萄糖水平;5.Western blot结果显示SGP组即益生菌组合治疗的小鼠下调了胰腺组织炎症信号通路(TLR-4、NF-κB/p-NF-κB)蛋白的表达,上调了小肠屏障蛋白(ZO-1、Claudin 1)的表达,且在基因转录水平(q-PCR)抑制了胰腺组织促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达,并上调了 PDX-1的表达,小鼠肠道的葡萄糖转运蛋白(SGLT-1、GLUT-2)表达被抑制;6.胰腺组织的免疫荧光切片结果显示,STZ注射后,小鼠的胰腺组织受到了极大的损伤,分泌胰岛素大量减少,益生菌治疗组即SGP组小鼠胰腺分泌胰岛素增加。结果二:糖水喂养小鼠模型1.小鼠血糖和粪便葡萄糖浓度的结果表明,糖水喂养的小鼠血糖水平升高,益生菌治疗组即GP组小鼠血糖和粪便葡萄糖浓度均下降;2.糖耐量结果表明GP组小鼠调控体内葡萄糖浓度的能力得到了加强;3.Western-blot结果显示益生菌治疗组即GP组下调了胰腺组织炎症信号通路(TLR-4、NF-κB/p-NF-κB)蛋白并上调了小肠组织屏障蛋白(ZO-1、Claudin 1)的表达,且在基因转录水平(q-PCR)抑制了胰腺组织促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达,上调了 PDX-1的表达,同时,肠道转运蛋白(SGLT-1、GLUT-2)的表达被抑制;4.胰腺组织切片的免疫荧光结果显示,模型组小鼠胰岛素减少,治疗组小鼠胰岛素增多至正常水平。结论:1.体外降糖实验证明了益生菌可以消耗大量葡萄糖;2.体内动物实验的结果证明了益生菌进入肠道后最终能达到降低体内血糖的目的;3.我们的研究发现除主要的降糖作用外,益生菌在体内还通过几条辅助途径来改善糖尿病,益生菌通过调节胰腺的TLR-4-NF-κB通路和促炎因子的表达抑制糖尿病小鼠的炎症。益生菌还可以改善糖尿病小鼠肠道屏障功能;4.我们从益生菌直接消耗葡萄糖的角度及其对糖尿病的治疗改善进行研究,预示着益生菌组合有望开发成糖尿病辅助治疗的食品、保健品以及药品。