杨树儿茶素合成相关基因DFR和LAR的克隆与功能初步分析

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ysabby2008
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在许多植物中,二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-Reductase,DFR)和无色花色素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)是抗菌物质儿茶素形成步骤中的两个关键酶。但在杨树中,这两种酶是否对儿茶素的合成途径产生影响作用并不清楚。为研究杨树中DFR和LAR基因在欧美杨细菌性溃疡病菌(Lonsdalea quercina subsp.populi)侵染后的表达量变化,探索DFR和LAR与儿茶素合成之间的关系,本研究通过对3个不同抗性品种的杨树在田间进行欧美杨细菌性溃疡病菌的接种,利用荧光定量PCR和高效液相色谱法(HPLC)分析不同杨树品种在接种病原菌后不同的时间段中DFR和LAR的表达量差异和儿茶素的含量变化,并从中林46杨(Populus×euramericanacv.‘Zhonglin46’)中克隆出DFR和LAR的ORF序列,构建植物表达载体,转化受体植物。用qRT-PCR检测转基因植株中相应基因的表达量,并用HPLC法检测转基因植株中儿茶素的含量。以期为抗病基因工程育种提供候选基因。研究主要结果如下:  对‘中菏1号’、‘107杨’和‘河南毛白杨’三个不同品种的一年生杨树苗在田间进行欧美杨细菌性溃疡病菌的接种,根据对接种后不同时间段发病情况的观察,‘中菏1号’发病最为严重,为高感品种;‘107杨’次之,为感病品种;‘河南毛白杨’不发病,为抗病品种。不同抗性品种杨树的DFR和LAR两个基因对溃疡病菌的侵染产生不同的响应。三个杨树品种中儿茶素的含量在病原菌的胁迫下均发生显著变化,且根据品种间抗病性的不同呈现出差异。儿茶素的上升比例大小为:抗病品种>感病品种>高感品种。表明儿茶素能够对溃疡病菌做出响应,且儿茶素与杨树的抗病性有关。  克隆出DFR基因和LAR基因的ORF序列,构建CaMV35S启动子调控的反义表达载体anti-pBI121-DFR和正义表达载体pCAMBIA1301-LAR。反义表达载体anti-pBI121-DFR通过农杆菌介导转化84K杨,得到4株完整的转基因植株。转基因株系中儿茶素的含量与野生型植株相比均降低,且差异显著。将正义表达载体pCAMBIA1301-LAR通过农杆菌介导转化烟草,得到6株完整的转基因烟草。在转基因植株中,LAR基因的表达量均显著上调,且有4株转基因烟草中内源儿茶素的含量大幅度增加。  上述研究结果表明,杨树中基因DFR和LAR在受到欧美杨细菌性溃疡病菌侵染后其表达量出现明显变化,中林46杨中DFR基因和LAR基因参与儿茶素的合成,且儿茶素可抑制病原菌的生长。这为通过转基因方法利用儿茶素合成相关基因增强树木抗病性,提供了理论参考。
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