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实验目的研究腹腔注射、灌胃、皮肤染毒丙烯酰胺(AA)对小鼠睾丸细胞损伤的影响；建立AA染毒小鼠模型,研究AA致雄性小鼠睾丸细胞凋亡作用及对波形蛋白表达的影响,进而研究波形蛋白表达与生精细胞凋亡的关系；探讨AA致雄性生殖毒性作用的靶细胞,为AA生殖毒性机制研究提供实验室依据。实验内容与方法第一部分将48只5周龄清洁级健康雄性昆明种小鼠随机分为4组,分别为空白对照组、腹腔染毒组、灌胃染毒组和皮肤染毒组,每组12只。染毒剂量为25 mg/kg,连续染毒5d,每天1次。观察染毒前后体重变化和睾丸系数。于首次染毒后第6天行单细胞凝胶电泳实验,第19天行睾丸早期精细胞微核实验。第二部分将7～8周龄40只清洁级健康雄性昆明种小鼠随机分为4组,每组10只。用不同剂量的AA(0、10、20、40mg/kg)对小鼠连续灌胃5w,每周6天,其中0mg/kg给予等体积蒸馏水,即正常对照组。于首次染毒AA后第36天处死小鼠,采用组织病理学技术(HE染色),流式细胞术(FCM), TUNEL法,免疫组织化学法,RT-PCR技术,分别从组织学水平,细胞水平,DNA水平,蛋白水平及mRNA水平,分析AA致睾丸细胞凋亡及其与波形蛋白表达的关系。实验结果1.腹腔染毒组和灌胃染毒组小鼠体重均显著减少(P<0.01)。三种染毒方式小鼠的睾丸重量及睾丸系数均较对照组明显降低(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组比较,各染毒组小鼠单细胞凝胶电泳结果：睾丸细胞DNA的尾长、尾部DNA%、尾矩、Olive尾矩均较高,差异均有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。2.三种染毒方式小鼠体重和睾丸重量均明显小于空白对照组(P<0.05或P<0.01)。而与空白对照组比较,睾丸系数差异没有统计学意义(P>0.05)。灌胃染毒组早期精细胞微核率显著高于空白对照组(P<0.05),而腹腔染毒组和皮肤染毒组早期精细胞微核率虽高于空白对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)3.HE染色结果显示：10 mg/kg组与正常对照组比较,小鼠睾丸曲细精管排列基本规则,各级生精细胞未见明显改变。20 mg/kg和40 mg/kg剂量组小鼠,曲细精管排列不规则,生精上皮层次减少,各级生精细胞减少,管腔内成熟精子减少,且有空泡形成。4.FCM结果显示,与对照组相比,各剂量染毒组的1C细胞明显减少,2C细胞的比例显著提高(P<0.01),且10 mg/kg和20 mg/kg剂量组1C和2C细胞的比例差异无统计学意义(P>0.05)。10 mg/kg和20 mg/kg剂量组4C细胞的比例较对照组增加,40 mg/kg组4C细胞的比例低于前两组,但仍高于对照组,且均有统计学意义(P<0.01)。各染毒组1C：4C,及1C：2C均明显低于对照组(P<0.01),但各染毒组两两比较,均无统计学差异(P>0.05)。4C：2C仅在40 mg/kg剂量组与对照组比较减少有统计学差异(P<0.01)。5. TUNEL法的检测结果表明,各剂量组的细胞凋亡指数显著高于正常对照组(P<0.05)。6.免疫组化结果显示,20mg/kg组和40mg/kg组波形蛋白表达的平均光密度值较正常对照组明显减少(P<0.05),1 Omg/kg较正常对照组减少但无统计学差异(P>0.05)。7. RT-PCR结果表明与正常对照组比较,各剂量组小鼠睾丸波形蛋白mRNA表达均明显降低(P<0.05)。结论1.在本实验条件下,三种方式染毒AA均可致雄性小鼠睾丸细胞产生DNA损伤,使小鼠睾丸早期精细胞微核发生率升高,且以灌胃染毒方式产生的毒性作用最为敏感；2.AA诱导可使小鼠睾丸曲细精管各级生精细胞减少,管腔内成熟精子减少。3.AA可以降低精原细胞转化为精子的效能,使精子细胞和精子数量减少,使生精过程发生障碍。其致细胞凋亡作用的靶细胞可能是精原细胞。4.AA诱导可使生精上皮凋亡指数增加,且有剂量依赖性。5.AA使得波形蛋白及mRNA的表达显著减少,且主要是间质细胞中的波形蛋白表达减少。推测AA生殖毒性作用的可能机制为AA染毒使波形蛋白mRNA表达减少,从而导致波形蛋白生成减少。6.AA致睾丸生精细胞凋亡与波形蛋白表达的减少有一定的相关性。