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第一部分Gax在胸主动脉瘤组织中的表达及其对胸主动脉平滑肌细胞表型转化的作用研究目的:探讨Gax在胸主动脉瘤组织中的表达水平,以及Gax对胸主动脉平滑肌细胞表型转化的影响方法:收集2016年9月至2017年9月在本院进行手术治疗的16例退行性变升主动脉瘤患者的胸主动脉瘤壁组织,正常对照组标本16例取自同一时期进行冠脉搭桥术的冠心病患者。通过Real-time PCR和Western blot方法检测Gax在胸主动脉瘤壁中膜组织中的mRNA和蛋白表达水平;应用消化贴壁法原代培养正常人胸主动脉平滑肌细胞和胸主动脉瘤血管平滑肌细胞,并通过细胞免疫荧光染色检测α-actin和Gax的表达水平;应用Ad-Gax或Ad-Gax siRNA转染VSMCs,通过Western blot方法检测Gax过表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs中Calpoin和SM-MHC 11蛋白表达的影响;通过CCK8方法检测Gax过表达或低表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs增殖的影响;通过Transwell方法检测Gax过表达或低表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs迁移的影响。结果:Real-time PCR和Western blot方法结果显示,胸主动脉瘤壁中膜组织中Gax的mRNA和蛋白表达均比正常主动脉明显降低。细胞免疫荧光染色结果显示,与冠心病患者来源的正常VSMCs相比,源自胸主动脉瘤的VSMCs中Gax和α-actin表达水平显著降低。Gax过表达能够引起有或无PDGF-BB刺激下VSMCs中Calpoin和SM-MHC 11蛋白的表达上调;CCK8方法结果显示Gax过表达能够明显抑制有或无PDGF-BB刺激下VSMCs的增殖,Gax低表达能够显著促进有或无PDGF-BB刺激下VSMCs的增殖;Transwell方法结果显示Gax过表达能够明显抑制有或无PDGF-BB刺激下VSMCs的迁移,Gax低表达能够显著促进有或无PDGF-BB刺激下VSMCs的迁移。结论:Gax在源自胸主动脉瘤壁的中膜组织和VSMCs中表达下调,以及Gax表达能够促进胸主动脉平滑肌细胞由合成表型向收缩表型转化。第二部分Gax调控下游靶基因Rap1A表达在VSMCs表型转化中的作用研究目的:探讨抑制性转录因子Gax通过下调Rap1A基因表达来调控胸主动脉平滑肌细胞的表型转化,并揭示胸主动脉瘤的发病机制。方法:采用基因芯片技术筛选出Gax过表达后VSMCs中的差异表达基因,并用Real-time PCR 和 Western blot 方法进行验证;应用 Western blot 检测 Rap1A在胸主动脉瘤壁中膜组织中的表达情况;应用细胞免疫荧光染色方法检测Rap1A在源自胸主动脉瘤的原代培养VSMCs中的表达水平;构建并鉴定重组慢病毒载体Lenti-RaplA,用含Rap1A基因的重组慢病毒载体转染VSMCs,应用Western bolt检测Rap1A的表达量,以及Rap1A的高表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs收缩表型标志物Calpoin和SM-MHC 11蛋白表达的影响;通过CCK8方法检测Rap1A过表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs增殖的影响;通过Transwell方法检测Rap1A过表达对有或无PDGF-BB刺激下VSMCs迁移的影响;在Ad-Gax和Lenti-RaplA联合转染VSMCs后,应用Western bolt观察Rap1A过表达对Gax过表达的VSMCs中Calpoin和SM-MHC 11蛋白表达的影响;应用CCK8实验观察Rap1A过表达对Gax过表达的VSMCs的细胞增殖的影响;应用Transwell实验观察Rap1A过表达对Gax过表达的VSMCs的细胞迁移的影响。结果:基因芯片技术显示抑制性转录因子Gax过表达后VSMCs中下调变化最为显著的是Rap1A基因,下调倍数为2.94,具有统计学差异(P<0.01);应用Real-time PCR和Western blot方法证实抑制性转录因子Gax过表达能够显著下调有或无PDGF-BB刺激下VSMCs中Rap1A的表达水平;Western blot方法结果显示,胸主动脉瘤壁中膜组织中Rap1A蛋白的表达比正常主动脉明显升高;细胞免疫荧光染色结果显示,与正常VSMCs相比,源自胸主动脉瘤的VSMCs中Rap1A蛋白表达水平显著升高。成功构建含Rap1A基因的重组慢病毒载体Lenti-RaplA,病毒滴度达3.5X 108 Tu/ml,并通过PCR鉴定,双酶切反应鉴定以及DNA测序鉴定正确;Lenti-RaplA转染VSMCs后引起Rap1A过表达,其能够引起有或无PDGF-BB刺激下VSMCs收缩表型标志物Calpoin和SM-MHC 11蛋白的表达下调;CCK8方法结果显示Rap1A过表达能够明显促进有或无PDGF-BB刺激下VSMCs的增殖;Transwell方法结果显示Rap1A过表达能够明显促进有或无FPDGF-BB刺激下VSMCs的迁移;Ad-Gax+Lenti-Rap1A转染组中VSMCs收缩表型标志物Calponin和SM MHC 11蛋白表达水平比Ad-Gax转染组和Ad-Gax+Lenti-EGFP转染组显著降低;Ad-Gax+Lenti-Rap1A转染组中细胞增殖和迁移能力比Ad-Gax转染组和Ad-Gax+Lenti-EGFP转染组明显增加。结论:Rap1A在胸主动脉瘤组织中表达上调,并且抑制性转录因子Gax介导的胸主动脉平滑肌细胞的表型转化过程是通过下调Rap1A基因表达来实现的。