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第一部分兔骨髓间充质干细胞的提取、鉴定及培养目的:从成年兔的四肢骨中分离提取骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行传代培养,同时对骨髓间充质干细胞进行鉴定,为后续实验提供实验细胞。方法:通过Percoll密度梯度分离法提取并扩增培养BMSCs,并通过流式细胞仪、成骨及成脂分化诱导培养基对BMSCs进行鉴定。结果:BMSCs原代及传代细胞状态良好,流式细胞仪、成骨及成脂分化诱导鉴定表明分离提取的BMSCs具有BMSCs特有的特征,说明分离提取成功。结论:实验所分离提取的兔四肢骨内的细胞鉴定为BMSCs,可用于后续实验研究。第二部分兔成骨细胞的提取、鉴定及培养目的:从成年兔的四肢骨膜中分离提取成骨细胞(osteoblasts,OB),并进行传代培养,同时对OB进行鉴定,为后续实验提供实验细胞。方法:采用骨膜源性的方法提取OB并扩增培养OB,通过吉萨姆染色、茜素红染色、扫描电镜对OB进行鉴定。结果:OB原代及传代细胞状态良好,吉萨姆染色、茜素红染色、扫描电镜对OB细胞进行鉴定,结果表明分离提取的OB细胞具有相应特性,说明分离提取成功。结论:实验所分离提取的兔四肢骨膜的细胞鉴定为OB细胞,可用于后续实验研究。第三部分淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成骨、迁移作用的最佳浓度及时间规律目的:验证淫羊藿苷(Icariin,ICA)能促进BMSCs的成骨分化和迁移的发生,寻找其发挥作用的最佳浓度和时间规律,以及发挥作用的信号通路。方法:实验过程大致分5个部分,分述如下:(1)用CCK-8试剂盒检测不同浓度的ICA对BMSCs活性和增殖的影响。(2)观察不同浓度ICA作用于BMSCs后形成的矿化结节情况。(3)观察3d、7d,ICA作用于BMSCs后成骨分化和迁移的m RNA、蛋白表达。(4)观察ICA作用于BMSCs后成骨、迁移表达的时间规律。(5)用si-Runx2、AMD3100验证ICA促进BMSCs成骨分化和迁移的信号通路。结果:(1)ICA浓度为1×10-7M、1×10-8M两个组有促进细胞增殖的作用。(2)ICA浓度为1×10-7M组的矿化效果最佳。(3)浓度为1×10-7M ICA作用于BMSCs促进其成骨、迁移的m RNA和蛋白表达量最高。(4)ICA作用下的BMSCs,在第3-4d时,成骨、迁移表达量达到第一个高峰,第7d时达到第二个高峰。(5)si-Runx2、AMD3100均能有效地抑制ICA促进成骨分化和迁移发生的作用。结论:ICA能明确促进BMSCs的成骨分化和迁移的发生,这两者是相伴进行的。ICA发挥作用的最佳浓度是1×10-7M,它是通过Runx2信号轴和CXCR4信号轴分别发挥成骨和迁移作用。ICA促进BMSCs成骨分化和迁移的发生存在时间规律。第四部分成骨细胞源性外泌体的提取及鉴定目的:复苏冻存的OB细胞进行传代并扩增培养,提取OB源性外泌体,进行相关鉴定,为后续实验提供材料。方法:将复苏后的成骨细胞常规培养,然后进行扩大培养,收集细胞上清液。通过两种方法(一是试剂盒,二是超速离心)提取OB细胞的外泌体,用透射电镜和Western blotting检测进行鉴定。结果:扩增培养的OB原代及传代细胞状态良好,透射电镜观察到外泌体的典型形态,Western blotting对OB源性外泌体进行Tsg101、Hsp70、CD63等外泌体标志性指标的检测,发现超离组和试剂盒组的上述指标性蛋白表达量明显高于空白组。结论:成功从OB细胞上清中分离提取到外泌体,超速离心和试剂盒,这两种方法所提OB源性外泌体可用于后续实验研究。第五部分淫羊藿苷联合成骨细胞源性外泌体对骨髓间充质干细胞成骨、迁移的作用目的:验证ICA联合成骨细胞源性外泌体(OB-exosome,OB-exo)对BMSCs具有明确的促进其成骨分化和迁移发生的作用。方法:分四个组,分别是空白组,ICA组、OB-exo组、ICA+OB-exo组,进行连续培养。于第3d,收集BMSCs,检测各组的成骨、迁移各目标m RNA、蛋白的表达情况。结果:通过q PCR、Western blotting检测发现,ICA组、OB-exo组、ICA+OB-exo组,三个组相比空白组均有明显升高,其中ICA+OB-exo组最高。结论:ICA联合OB-exo对BMSCs具有明确的促进其成骨分化和迁移发生的作用。第六部分成骨细胞源性外泌体的高通量测序及miRNAs分析目的:鉴定成骨细胞源性外泌体的成分,预测靶点miRNAs,为后续实验验证做参考。方法:将复苏后的成骨细胞常规培养,并进行扩大培养,收集细胞上清液,采用超速离心法提取外泌体,进行高通量测序。运用相关软件对所检测结果进行分析。结果:外泌体中含有mi RNA总量占全部成分的17.47%,通过软件对mi RNA的靶基因进行预测,找到相关目标mi RNA为mi R-122-5p。结论:预测mi R-122-5p与成骨分化、迁移等生物学作用密切相关,将mi R-122-5p作为后续研究的参考。第七部分淫羊藿苷调控成骨细胞源性外泌体mi R-122-5p对骨髓间充质干细胞成骨、迁移作用目的:验证ICA调控OB-exo对BMSCs发挥作用的靶点mi RNA是mi R-122-5p。方法:实验过程大致分2个部分,分述如下:(1)四个组(mi R-122-5p minic NC组、mi R-122-5p minic组、mi R-122-5p minic NC+ICA组、mi R-122-5p minic+ICA组),作用于BMSCs,连续培养3d,检测BMSCs的成骨和迁移表达情况。(2)四个组(mi R-122-5p inhibitor NC组、mi R-122-5p inhibitor组、mi R-122-5p inhibitor NC+ICA组、mi R-122-5p inhibitor+ICA组),作用于BMSCs,连续培养3d,检测BMSCs的成骨和迁移表达情况。结果:(1)mi R-122-5p minic+ICA组在各项成骨、迁移m RNA和蛋白的表达量中最高。(2)mi R-122-5p inhibitor+ICA组在各项成骨、迁移m RNA和蛋白的表达量中降低。结论:ICA是通过调控OB-exo中的mi R-122-5p发挥作用的。