早在1955年人类首次在针对犬的缺血模型进行的研究中发现,结扎犬的冠状动脉,如果立即解除结扎恢复血供,部分实验犬会突然出现室颤并最终死亡。1960年首次提出了心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）的概念,肝脏的缺血再灌注损伤常见于肝移植、休克以及肝脏的介入治疗,是影响患者预后的重要因素之一,肝脏缺血再灌注损伤的发生机制较为复杂,研究较多的有氧化应激、钙超载、炎症反应、线粒体损伤及膜通透性改变等,这些机制互相关联、相互作用,最终导致细胞死亡。在危重症领域,肝脏缺血再灌注损伤极为常见,而不同于肾功能衰竭、呼吸衰竭的替代治疗,目前对于肝脏的替代治疗手段极为缺乏,即便有部分替代疗法,也难以替代肝脏的合成功能,因此深入开展肝脏缺血再灌注损伤的发病机制研究,对于寻找和发掘治疗药物具有重要的科学意义。甲烷（mathane,CH₄）是大气中的常见的有机气体,是沼气的主要成分,是消耗臭氧的原料,是温室气体的一种,具有可燃性,在水中的溶解度较低。传统上认为甲烷是由厌氧菌在厌氧环境下产生的,传统认为自然界中的甲烷除来自有机物或者石油等的燃烧产生外,最大的来源是厌氧菌在厌氧环境下所产生的,人体产生甲烷的主要部位是结肠,主要以厌氧菌史氏甲烷短杆菌为主,占比约94%,但是随着研究的深入,2006年Kelpper发表在《Nature》上的研究排除了厌氧菌的参与,发现玉米和黑麦草活体在暴露于阳光下时甲烷释放增加,随后的研究进一步发现动物和植物细胞在氧化应激的刺激下可自主产生甲烷,并且明确产生的部位是线粒体,这些研究证明细胞可自主产生甲烷而无需厌氧菌的参与,但是线粒体是如何产生甲烷的,目前为止机制尚不完全清楚,有研究推测生物分子中的甲基比如磷脂酰胆碱可能是甲烷的潜在来源,也有研究认为在氧化应激条件下,线粒体DNA的甲基化,改变了基因的表达,也影响了s-腺苷同型半胱氨酸水解酶（s-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SAHH）的表达和活性,并且可以改变蛋氨酸的代谢,在这中间,甲烷可以作为中间代谢产物释放。Althoff等的研究结果为这种学说提供了支持,他的研究提出在高度氧化条件下,在常温和大气压下,有机硫化物比如蛋氨酸可以先被氧化成相应的亚砜,然后通过均键的断裂去甲基化产生甲烷。通常认为甲烷是一种惰性气体,不参与机体的代谢,但是早在1967年Dougherty等将用C¹⁴标记的甲烷注入绵羊循环系统,在绵羊呼出气中发现了含有C¹⁴的二氧化碳（CO₂）,初步发现甲烷可能参与了机体的碳循环。2012年Boros在犬的肠道IRI模型中发现外源性添加甲烷具有抗炎作用,随后进行的多项研究发现甲烷对多个脏器（肝脏、肾脏、心脏、视网膜、脊髓等）的IRI具有保护作用,这些研究发现了甲烷的抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡的作用,甲烷有成为治疗器官缺血再灌注损伤气体的潜力。综上,甲烷是在氧化应激的条件下由线粒体产生的,同时线粒体产生了人体95%的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,释放的细胞色素C是细胞凋亡的关键步骤,既然线粒体和氧化应激紧密相关,又是产生甲烷的细胞器,那么可能线粒体是甲烷发挥抗氧化作用的靶点,因此本文以肝缺血再灌注损伤为模型,验证甲烷的抗氧化作用,研究外源性甲烷对线粒体的影响,初步了解线粒体的变化,为研究甲烷的抗器官缺血再灌注损伤作用的机制寻找方向。研究目的:以小鼠肝脏缺血再灌注损伤为模型,验证甲烷生理盐水的保护作用,验证甲烷的抗氧化应激作用,进一步检测肝细胞线粒体呼吸链复合物I～V活性、亚基蛋白表达,PGC-1α蛋白表达、DLP1、Mfn1、Mfn2、OPA1、PINK1等蛋白表达,初步了解甲烷对线粒体的影响,为进一步研究提供方向。研究方法:采用70%小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,随机分为3组（SHAM组、IR组和IR+CH₄组,n=6）。Sham组为假手术组:打开腹腔暴露肝脏后再关闭腹腔;IR组为缺血再灌注:肝脏缺血1h,再灌注6h,再灌注前腹腔内注射生理盐水0.5ml;IR+CH₄组为缺血再灌注甲烷生理盐水处理组:肝脏缺血1h,再灌注6h,再灌注前腹腔内注射甲烷生理盐水0.5ml。再灌注到时间后采用眼球取血法留取小鼠血液0.3～1ml,检测线粒体呼吸链复合物I～V活性、亚基蛋白表达,PGC-1α蛋白表达、DLP1、Mfn1、Mfn2、OPA1、PINK1等蛋白表达。数据使用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析和处理,计量资料以均数±标准差（?x±s）的形式表示,组间比较行非配对t检验,多组间的比较采用单因素方差分析,有差异进一步行Tukey法事后比较,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.IR组AST和ALT显著升高（P<0.05）,与IR组相比,IR+CH₄组的AST和ALT下降恢复（P<0.05）。2.IR组MDA和ROS水平升高（P<0.05）,GSH和SOD水平降低（P<0.05）,与IR组相比,IR+CH₄组降低了MDA和ROS水平（P<0.05）,提高了GSH和SOD水平（P<0.05）。3.线粒体呼吸链复合物I～V活性在3组间无显著差异,IR组中呼吸链复合物I、IV、V的亚基蛋白表达增加（P<0.05）;PGC-1α蛋白表达差异无统计学意义。4.与SHAM组相比,IR组Mfn1和OPA1表达减少（P<0.05）,DLP1表达增加（P<0.05）,Mfn2升高可能是Mfn1下调的代偿。与IR组相比,IR+CH₄组Mfn1增加（P<0.05）,DLP1表达下降（P<0.05）,提示甲烷生理盐水可促进线粒体融合,减少其分裂,使线粒体恢复动态平衡。5.与SHAM组相比,IR组PINK1蛋白表达增加（P<0.05）,线粒体内Parkin表达增加（P<0.01）,而线粒体外Parkin表达减少（P<0.01）;与IR组相比,IR+CH₄组PINK1、线粒体内Parkin蛋白表达均下降（P<0.05）,这些结果说明IRI时细胞试图通过PINK1蛋白的高表达来促进Parkin蛋白向线粒体内转移,进而启动线粒体自噬,清除受损的线粒体,而CH₄可有效逆转PINK1（P<0.05）和线粒体内Parkin蛋白的上调,提示甲烷生理盐水可能促进了线粒体功能的恢复和损伤线粒体的清除。研究结论:1、甲烷具有对抗缺血再灌注损伤保护肝功能的作用,具有抵抗氧化应激的作用。2、甲烷对线粒体稳态有积极作用,可促进线粒体融合,减少分裂,恢复自噬,使线粒体恢复动态平衡。