脂质代谢紊乱会导致多种系统疾病的发生,如高血脂症、糖尿病、动脉粥样硬化等。苯并芘(benzo(a)pyrene)是一种食品加工污染物。它的来源一是工业排放影响土壤间接污染食品;二是不适当的油炸、烟熏、烹饪、烧烤等。苯并芘具有脂毒性、致畸性、免疫毒性和遗传毒性。据报道,苯并芘的长期暴露能诱导细胞脂质异常积聚,对人体危害极大。自噬是真核细胞的调节机制,主要通过溶酶体降解受损的细胞器、异常折叠的蛋白和细胞碎片,来维系细胞环境的稳态。当受到外界干扰时,自噬发生以实现机体的自身修护。研究发现,苯并芘可诱导细胞产生自噬性损伤,但对自噬信号转导及细胞生存影响的了解尚不全面,关于自噬的发生机制还有待进一步研究。近年来,大量的实验证明了自噬功能紊乱和脂质异常积聚有着密切联系。因此,本研究主要目的是探究苯并芘对RAW264.7细胞脂质积聚和自噬的影响及机制,并对营养干预剂进行筛选。本论文的主要研究内容及结果如下:(1)苯并芘诱导RAW264.7细胞脂质积聚的研究。通过噻唑蓝(MTT)实验筛选苯并芘的无细胞毒性剂量为0-40μM;通过油红O染色、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量检测,确定苯并芘能够诱导脂质积聚;通过加入自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)、抑制剂氯喹(CQ),确定苯并芘诱导的脂质积聚与自噬的抑制有关。(2)苯并芘抑制RAW264.7细胞自噬及机制研究。通过Western Blot法检测LC3蛋白表达确定苯并芘在6 h,40μM浓度时显著影响自噬;通过透射电镜观察到40μM苯并芘使自噬小体显著蓄积;通过加入自噬抑制剂和m RFP-GFP-LC3腺病毒转染,确定苯并芘阻断自噬流;利用免疫荧光染色、LAMP-2蛋白表达和溶酶体p H检测,确定苯并芘不抑制自噬小体和溶酶体的融合,但会导致溶酶体p H升高,降解能力降低。(3)营养干预剂对苯并芘诱导脂质积聚的改善作用。通过MTT实验筛选出红景天苷(Salidroside)、大蒜素(Allicin)、蒜氨酸(Alliin)的无细胞毒性剂量分别为0-100μM、0-50μM、0-1600μM;通过油红O染色、TC、TG含量检测,确定三种干预剂在50μM均能显著降低细胞内脂滴、TC和TG含量,起到降脂作用;通过溶酶体p H和c AMP活性检测,确定三种营养干预剂均能有效改善溶酶体p H,提高c AMP的活性。综上所述,本研究从细胞水平观测到苯并芘能诱导RAW264.7细胞的脂质积聚,发现苯并芘抑制细胞自噬,阻断自噬流,揭示溶酶体环境碱化是自噬流阻断的原因,确定红景天苷、大蒜素、蒜氨酸等营养干预剂能有效改善苯并芘诱导的脂质积聚,为苯并芘的暴露危害和控制新方案的建立提供了实验依据和数据支撑,具有重要理论和实践意义。