苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)ORF82功能研究

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杆状病毒(Baculoviruses)是一种专性感染无脊椎动物的双链超螺旋DNA昆虫病毒。由于杆状病毒对环境和人畜无害,在生物防治、药物研发、疫苗生产以及基因治疗等方面发挥着重大作用。杆状病毒全基因组测序完成后,杆状病毒基因功能研究已成为杆状病毒领域研究热点。因此,研究杆状病毒基因功能有着重要意义。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple Nucleopolyhedroviruses,AcMNPV)是杆状病毒的代表种目前尚有部分基因的具体功能不太清楚。本文以ac82基因为研究对象,利用Red同源重组系统和Bac-to-Bac系统构建了ac82缺失型及回复型重组病毒,探讨了缺失ac82对杆状病毒的影响,进而揭示此基因的功能。主要研究结果包括以下内容:一.利用Red重组系统,用氯霉素抗性基因(Cm)替代了AcMNPV Bacmid中ac82的64 bp序列,成功构建了缺失ac82基因的重组病毒vAc82KO2KO Bacmid。二.利用Bac-to-Bac系统,成功构建了表达GFP的野生型病毒vAc PH-GFP,缺失型重组病毒vAc82KO-GFP和回复型重组病毒vAc82Rep-PH-GFP。三.转染和感染。将构建成功的重组病毒转染细胞都产生了荧光,说明本研究成功构建了表达GFP的野生型病毒vAcPH-GFP,缺失型重组病毒vAc82KO-PH-GFP,回复型重组病毒vAc82Reyp-PH-GFP。转染实验表明,缺失型重组病毒vAc82KO-PH-GFP2KO-PH-GFP Bacmid转染细胞后并没有发生病毒的扩散,证明该基因的缺失使病毒粒子不能正常出芽穿出细胞去感染其它临近细胞,推测缺失ac82影响到了病毒的出膜过程。感染实验表明,缺失型重组病毒vAc82KO-PH-GFP感染细胞后,随着感染时间的延长,直到感染96h,荧光出现扩散。揭示了缺失ac82后不影响有感染性BV的产生,只是延迟了BV的产生。
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