背景肝癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一。肝癌流行病数据显示,我国是一个肝癌高发国家,每年死于肝癌的患者有38万,肝癌死亡例数占全球51%,,肝癌位居我国肿瘤发病率第四位(28. 71/10万人),死亡率第二位(26. 04/10万人)。目前肝癌的病因及发病机制尚不完全明确。动物和植物中都有解偶联蛋白(UCP)存在,它是线粒体阴离子载体蛋白超家族的一个子类。哺乳动物中,基因组编码UCP的5个同源蛋白(UCP1到UCP5),其中UCP1到UCP3具有高度同源性。UCP蛋白位于线粒体内膜上,最初认为它的功能是调节产热质子漏。UCP1和UCP3有一定的组织特异性,UCP1见于棕色脂肪组织,UCP3见于骨骼肌,而UCP2则可见于多种组织,如肝、脑、胰腺、中枢神经系统和免疫系统。解偶联蛋白2 (UCP2)及其家族中的其他蛋白分子的主要作用是抑制线粒体活性氧(ROS)的产生,并使细胞免受过氧化物的损伤。UCP1在调节适应性产热中发挥着重要作用,而UCP2和UCP3则主要降低电子转运中产生的活性氧(ROS)。ROS是正常氧化代谢的产物。在生理状态下,ROS参与细胞信号转导,调节细胞功能,如细胞增殖、炎症、凋亡和吞噬作用。但是,在应激状态下,ROS可快速明显升高,引起氧化应激,导致细胞损伤。UCP蛋白能够调节ROS,而ROS又参与细胞功能调节,因此我们推测UCP蛋白可能与肿瘤的发生发展有关。实际上,UCP2在肝癌细胞系和结肠癌中都有表达升高的现象。已有研究证明,在结肠癌细胞中,ROS水平与UCP2和UCP5表达水平呈正相关,提示我们UCP蛋白表达上调可能与氧化应激有关。而且,已有研究显示,p53是UCP蛋白的作用靶点。细胞氧化应激水平可能引起p53调节的细胞生长停滞或启动细胞死亡。UCP2可能通过改变p53应答和协助癌细胞存活调节ROS。大量的研究表明,UCP2在肿瘤发生中起着关键的作用,这提示我们UCP2可能是抗肿瘤治疗的一个重要靶点。最近的证据表明癌细胞中UCP2表达的增加不仅仅是氧化应激的标志物,UCP2也可能有助于具有增强的适应能力的癌细胞的选择。源自白血病和黑素瘤的癌细胞的药物抗性亚系表现出UCP2水平的增加,△ ψm的降低和对细胞毒性作用易感性的降低。类似地,UCP2高表达的人胆管癌细胞系比低UCP2表达细胞系对凋亡刺激更具抗性。这些结果表明UCP2与癌细胞的上皮以及间充质来源的化学抗性相关。UCP2在癌细胞中的保护作用最近已经通过在HCT116人结肠癌细胞中过表达UCP2来证实,所述细胞在用UV辐射和化疗剂治疗时具有降低的细胞凋亡率。这些实验表明,异位UCP2表达与较少量的喜树碱诱导的PUMA- α相关,所述PUMA-α是肿瘤抑制基因p53靶向的必需促凋亡蛋白。此外,来自UCP2过表达的HCT116细胞的肿瘤异种移植物的伊立替康诱导的消退显著降低,表明UCP2可以增加结肠癌细胞的体内化学耐药性。这些研究结果提供了迄今为止UCP2作为肿瘤细胞存活和生长的允许因素的最强有力的证据。氧化应激的诱导是很多常用的化疗药物常见的效应途径,如吉西他滨(GEM)。然而,GEM单独或联合奥沙利铂对提高肝癌患者的生存率几乎没有任何益处。线粒体解偶联蛋白2 (UCP2)能够抑制线粒体活性氧(ROS)的产生,从而减轻氧化应激诱导的细胞凋亡。一些研究已证实,在肿瘤细胞中抑制UCP2能够使抗药的肿瘤细胞对细胞毒性试剂致敏。这些数据还表明,这些药物对癌细胞的增敏效应主要通过增加ROS水平,这可能会进一步导致细胞死亡。另一方面,UCP2除了有调节胞内ROS水平的作用,以前的研究也表明UCP2可以调节p53 ,后者是一关键的肿瘤抑制因子,能够在细胞应激下引起凋亡性细胞死亡。不像某些肝癌细胞表达突变的p53 (Huh7)或p53缺失(Hep3B),HepG2细胞表达功能性的野生型p53,并且p53基因在HepG2细胞的激活可以作为识别基因损伤的新方法。由于p53和NF- κ B依赖的凋亡途径已在HepG2细胞中得到证实,很可能在HepG2细胞中抑制UCP2可以恢复p53的功能进而增加细胞的凋亡。综上,UCP2是肿瘤治疗的一个重要靶点。我们猜想,肝癌细胞对GEM的耐药性是否与UCP2的表达有关?是否能通过靶向调节UCP2的表达水平来增加肝癌细胞对GEM的敏感性?因此,在本课题中,我们探索了解偶联蛋白2介导肝癌细胞对吉西他滨敏感性的重要作用。目的1、检测不同肝癌细胞系UCP2的表达水平。2、研究肝癌细胞系UCP2的表达水平与肝癌细胞对吉西他滨的耐药性的关系。3、是否能通过靶向调节UCP2的表达水平来增加肝癌细胞对GEM的敏感性。4、研究通过基因沉默抑制肝癌细胞中UCP2的表达水平,是否对细胞的凋亡有诱导作用。方法1.细胞,质粒,siRNA,转染肝癌细胞系HuH6、Hep3B、HepG2和HLE,并用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。转染试剂选用LipofeetamineTM 2000,将质粒和siRNA转染入细胞内。靶向UCP2的siRNA,随机序列的scramblesiRNA用作对照组。UCP2基因的开放阅读框ORF利用PCR技术从HepG2细胞的cDNA中克隆获得,并连接到pcDNA3. 1表达载体。GEM和FCCP (4-三氟甲氧基苯腙)在蒸馏水和95%乙醇中溶解后存储在-20℃备用。2.分离线粒体为了提高UCP2蛋白的浓度,避免其他蛋白的干扰,我们从小鼠脾脏和不同的细胞系中分离线粒体。用0.25 mol/L的蔗糖,2 mmol/L的EDTA, 10 mmol/L的Tris-HC], 5×104U/L肝素(SETH)配置匀浆液,匀浆液降温至冰温时加入细胞。将得到的匀浆600g离心10分钟。吸取含有线粒体的上清再次离心14,0 000g*10分钟,沉淀为线粒体颗粒。弃上清,将得到的线粒体颗粒沉淀用SETH重悬。3.免疫印迹分析我们用免疫印迹法检测不同肝癌细胞系中UCP2的含量。用Laemmlli缓冲液将细胞或线粒体提取物裂解,裂解得到的蛋白用SDS-PAGE进行蛋白电泳。SDS-PAGE电泳后,将分离的蛋白转移到PVDF膜上,加入特异性兔抗UCP2抗体或者PARP-1抗体。用山羊抗兔辣根过氧化物酶IgG二抗与一抗特异性结合,并用显影液进行显影。膜上同时孵育GAPDH抗体作为内参校正。用ChemiDoc XRS图像系统采集发光图片。图片分析采用Quantity One软件。4.细胞增殖测定细胞增殖用MTT法进行检测。测量的吸光度为570 nm,并在690 nm进行校正。来自三组独立实验的结果取均值± S.D.,并用相对吸光值(A)来表示。5.线粒体超氧化物的测定非荧光的MitoSox探针用于评估线粒体超氧化物的产生。细胞以5×103/孔被接种在96孔板中,并以指定浓度加入不同化合物孵育16小时。之后向培养基中加入0.5 μ M探针MitoSox于37℃孵育15min,接着用Hanks缓冲液冲洗(20mM HEPES, ph7. 2, 10mM 葡萄糖,118mM 氯化钠,4. 6mM 氯化钾,1mM CaCl2)。荧光信号用430 nm激发光和590 nm发射光测量。该探针能够穿透活细胞,并迅速而高特异性地标记到被氧离子氧化后产生荧光信号的线粒体。数值经MTT法测量的细胞增殖进行标准化。6.通过测定caspase的活性来评估细胞凋亡细胞以5×103/孔接种在96孔板中并加入各种不同浓度的化合物处理48h。然后细胞用caspase抑制剂FLICA于37℃标记60 min。然后细胞用缓冲液冲洗两次,荧光信号用485 nm激发光激发,535 nm发射光测量。数值经MTT法测量的细胞增殖进行标准化。结果1.我们寿险检测了内源性UCP2在四种不同的肝癌细胞株(HuH6,Hep3B,HepG2和HLE)中的表达。HuH6,Hep3B和HepG2细胞中UCP2蛋白呈稳健表达,而在HLE中UCP2表达与其他三个细胞系相比明显受抑制。由于内源性UCP2表达水平能够反映细胞对GEM诱导的细胞生长抑制的抵抗和线粒体超氧化物的产生。HLE细胞对GHM诱导的细胞生长抑制最为敏感,并且产生了最多的线粒体超氧阴离子。用GEM和FCCP同时处理细胞,能够显著提高GEM诱导的细胞生长抑制的抗性,并抑制线粒体超氧化物的产生。2.免疫印迹实验验证了UCP2在HLE细胞中的过表达,以及使用两种不同的siRNA将其在HuH6中的沉默。在HLE细胞中异位过表达UCP2能够逆转GEM诱导的细胞生长抑制的敏感性,并显著降低线粒体超氧化物的产生。相反,用两个不同的siRNA靶向序列沉默UCP2的表达能够显著提高GEM诱导的细胞生长抑制和线粒体超氧化物的产生,而对照siRNA则没有这个效应。由于不同肝癌细胞株中UCP2的表达水平具有高度异质性,我们接下来明确了针对UCP2的靶向治疗是否只有在UCP2大量表达或者象在HLE细胞中仅抑制少量表达即可对细胞生长产生影响。即使是对HLE细胞基础水平UCP2表达的siRNA沉默也增加了细胞对GEM介导的生长抑制的敏感性。同时伴随着线粒体超氧化物的增加。总之,我们的数据表明UCP2的表达对于能否应用GEM来成功抑制肝癌细胞的生长方面具有重要的核心作用。3.细胞凋亡通过测定caspase-3和caspase-7的活性来评价。在HuH6,Hep3B和HepG2三个细胞系转染两条不同序列靶向UCP2的siRNA后,caspase-3和caspase-7的活性均提高,而对照siRNA则不受影响。结论1. UCP2表达的不同稳态水平决定细胞对吉西他滨的敏感性。UCP2低表达的HLE细胞对吉西他滨诱导的细胞生长抑制最为敏感。2.我们的数据表明细胞对吉西他滨的敏感性受UCP2水平的调控。UCP2的表达对于能否应用GEM来成功抑制肝癌细胞的生长方面具有重要的核心作用。3.在肝癌HuH6、Hep3B和HepG2细胞中,由RNAi介导的UCP2沉默能够促进细胞凋亡4. UCP2在肝癌中是一个重要的治疗靶点。抑制UCP2可与其他化疗药物发挥协同作用。背景解偶联蛋白(UCP)家族是一类在动植物中广泛表达的线粒体阴离子载体。哺乳动物的基因组编码解偶联蛋白1到5 (UCP1-5)。在这五个同系物中表达最普遍的是解偶联蛋白2 (UCP2),已发现在骨骼肌、脑、胰腺、肝脏和免疫细胞中均有表达。UCP2基因定位于染色体11q13. 4,编码309个氨基酸的蛋白,分子量为33. 299 kDa。UCP2在线粒体内膜上大量表达,同时也表达在细胞核、过氧化物酶体、细胞质和细胞膜。UCP2与解偶联蛋白3(UCP3)结合在一起抑制电子传递链介导的活性氧(ROS)的产生。生理水平的活性氧参与多种细胞功能,包括炎症、细胞凋亡、吞噬和增殖。然而,活性氧的过量生产会导致氧化损伤。鉴于UCPs在保持ROS的动态平衡和细胞周期方面的重要作用,其在细胞中的异常表达具有致瘤效应是不足为奇的。UCP2被发现在肝癌(HCC)和结肠癌中过表达。在结肠癌细胞中,UCP5也是过表达的。目前的证据表明,UCP2作用于p53,能够逆转氧化应激引发的p53介导的前凋亡信号。我们最近的研究表明UCP2的表达能够介导细胞对吉西他滨(GEM)的抵抗,后者主要和奥沙利铂联用应用于肝癌的化疗中,并且抑制UCP2能够使肝癌细胞对GEM的治疗更敏感。鉴于UCP2在HCC中的重要作用,阐明决定UCP2在肝癌细胞中表达水平的调控机制势在必行。由于在不同的肝癌细胞系中UCP2蛋白表达差异与其转录水平的变化并不同步,这说明存在着转录后或翻译后水平的调控机制。miR是一类内源性非编码RNA,其在真核细胞的生长、增殖和凋亡中起重要作用。可影响功能基因的表达,从而影响肿瘤的发生和进展,并且可以在转录后水平上调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和转移。最近的研究显示,miR-214在包括宫颈癌、卵巢癌、食道癌等众多恶性肿瘤中表达明显下调,并且可通过基因治疗手段在肿瘤细胞内高表达miR-214 ,以此干扰多种肿瘤细胞增殖、转移和侵袭,并发挥促进细胞凋亡等多方面作用。然而,目前miR-214对肝癌增殖能力的抑制作用及其分子机制尚不清楚。目的1、研究UCP2蛋白在肝癌细胞系中差异表达的机制。2、研究在肝癌细胞中是否UCP2表达被miRNA所调控,以及UCP2是否是miR-214的直接靶点。3、研究miR-214在肝癌样本中表达情况,以及在肝癌组织样本中miR-214表达与UCP2表达之间的相关性。4、研究调控miR-214水平对肝癌细胞的增殖的影响。方法1、临床标本、组织处理新鲜冰冻或石蜡包埋的肝癌组织及相应的癌旁组织标本取自25位于山东大学齐鲁医院手术的患者。所有病例均经病理和组织学的进一步诊断证实为肝细胞肝癌,拥有完整的临床病理及随访资料。25位患者术前均未进行过局部或全身治疗。新鲜获取的组织浸泡在RNA later液中,并在术后30分钟内速冻。然后存储在液氮中备用。2、细胞培养肝癌细胞系HuH6和HLE购自 ATCC,用DMEM培养基辅以10%胎牛血清(Gibco)和 100l.U./ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素(Gibco))于 37 ℃ 培养在CO2孵箱中。3、线粒体的分离从不同细胞株中分离线粒体的方法如前所述。4、RNA和miRNA的提取及实时定量PCR用Trizol从体外培养的细胞和肿瘤组织中分离RNA。逆转录试剂盒RevertAidTM。并用TaqMan探针法进行实时定量PCR反应。18s rRNA被用作内参以评估UCP2基因的转录水平。数据由18srRNA进行标准化,并用-△△Ct方法进行分析。根据制造商说明书,使用mirVanamiRNA分离试剂盒从组织和细胞中提取miRNA,并用TaqMan miRNA试剂盒检测hsa-miR-214和 U6 small nuclear RNA(RNU6B)。数据用 RNU6B 进行标准化,并用-△ △Ct方法进行分析。5、mRNA稳定性的测定HuH6和HLE细胞分别用10uM放线菌素D(Sigma-Aldrich)处理0.5、2、4、6、8、10、12小时,然后进行RNA提取。通过实时定量PCR来测定UCP2基因表达水平,并与未用放线菌素D处理的细胞中UCP2水平进行对比。相同样本中基因的相对表达由TBP进行标准化(TaqMan ID:Hs00427620_m1),数据在相应时间点转换为剩余mRNA的百分数来表示。6、免疫印迹分析免疫印迹用兔抗UCP2抗体(Santa Cruz)如前所述进行分析。所有样品用GAPDH作内参,以确保相同蛋白上样量。7、细胞增殖测定细胞增殖用MTT法检测(Sigma-Aldrich)[14],三个独立复孔的结果用mean士S.D.来表示。8、质粒从Origene获得带有UCP2基因3’UTR克隆的质粒pMirTarget。然后通过该克隆扩增内源性UCP2基因3’UTR进行报告载体的构建。在扩增片段的5’端和3’端加上Xhol和Apal酶切位点,并插入到Rr-luc-6XCXCR4 (Addgene plasmid 11308)海肾荧光素酶载体。通过点突变去除hsa-miR-214相应的6-16区域的结合位点来构造UCP2基因3’UTR的突变体,萤火虫荧光素酶载体被用作所有荧光素酶测定的转染和标准化对照。载体经加利福尼亚州圣克鲁兹分校(UCSC)测序验证。9、转染与荧光素酶检测利用脂质体Lipofectamine LTX(Life Technologies)将荧光素酶报告载体瞬时转染细胞(4×104)。miR-214mimic 或其抑制剂(Life Technologies)与UCP2 基因3’UTR构建载体。转染48小时后,海肾和萤火虫荧光素酶活性使用双重荧光素酶报告系统(Promega)进行连续测定。每个报告质粒至少在三个平行孔中转染两次(不同时间点)。数据经标准化后用相对荧光单位RFU 士S.D.来表示。10、统计分析SPSS版本20.0 (IBM)被应用于所有的统计学分析。双侧P值<0.05被认为有统计学意义。结果1、在不同的肝癌细胞系中UCP2蛋白表达水平迥异。在HuH6细胞中UCP2蛋白稳健表达,而在HLE细胞中表达被抑制。然而,UCP2在HLE细胞中的转录水平显著高于HuH6细胞(7±0. 3倍,P<0. 05)。这表明,UCP2蛋白在这些细胞中的差异表达存在转录后或翻译后调控机制。放线菌素-D处理后的mRNA稳定性显示,UCP2的半衰期在两个细胞株没有显著性差异。我们进一步检测是否UCP2被miRNA所调控。使用TargetScan平台原位预测表明,miR-214在UCP2的3’ UTR具有两个相邻的假定的结合位点。2、实时定量PCR结果显示,miR-214表达在HLE细胞中上调,而在HuH6细胞中下调。在25例肝癌及其癌旁组织标本中检测miR-214的表达水平,结果显示与正常对照相比(中位数,68. 87;极差,38. 17 - 91.42) (P<0.001), miR-214的表达在肝癌组织中显著下调(中位数,6.39;极差,1.25-9.01)。3、我们进而检查在HuH6细胞中通过转染miR-214模拟物mimic ,以及在HLE细胞中转染miR-214抑制剂是否会影响细胞的增殖率。结果显示,与对照相比,转染miR-214 mimic 24, 48和72 h后显著降低了HuH6细胞的活力(P<0.05)。反之亦然,miR-214抑制剂明显促进了不同时间点HLE细胞的增殖(P<0.05)。4、首先含有野生型UCP2 3’ UTR的荧光素酶报告载体被转染到HuH6和HLE细胞。与EuH6细胞系相比,HLE细胞中的UCP2 3’ UTR被抑制了9.8±0. 34倍(P =0.0037)。为了明确该效应是由于miR-214靶向UCP2 3’ UTR引起的,我们通过删除假定结合位点的6- 16核苷酸,设计合成了miR-214结合的UCP2基因3’ UTR的突变体。该突变体在HuH6和HLE细胞中荧光素酶活性并没有表现出任何差异,表明在这些细胞中UCP2 mRNA是miR-214的直接靶点。我们进一步证实了该结论。在HLE细胞中转染miR-214模拟物以及在HuH6细胞中转染miR-214抑制剂后发现,mir-214模拟物抑制了HuH6细胞中UCP2 3’ UTR的报告酶信号(P<0.05),而miR-214抑制剂恢复了HLE中UCP2 3’ UTR的报告酶活性(P<0. 05)。5、我们检测了20例肝癌患者miR-214和UCP2的表达,结果10例miR-214表达偏高,10例偏低。拥有高表达miR-214的十例皆为N0,N1的患者(非转移性),而低miR-214表达的则为高转移性的病例。我们的研究结果表明,在肝癌组织标本中miR-214表达的下调与UCP2表达增高之间存在动态的负相关性(P<0. 005, r =-0.9792)。结论1、在不同的肝癌细胞系中UCP2蛋白表达水平迥异。UCP2蛋白在这些细胞中的差异表达存在转录后或翻译后调控机制。UCP2是miR-214的靶基因。2、miR-214在肝癌样本中表达下调。3、调控miR-214水平能够影响肝癌细胞的增殖。4、在肝癌细胞中UCP2是miR-214的直接靶点。5、在肝癌组织标本中miR-214表达的下调与UCP2表达增高之间存在动态的负相关性。