论文部分内容阅读
糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,具有多种生物学功能,如免疫识别、信号转导、细胞粘附以及肿瘤发生等。糖链从蛋白骨架的释放是研究其结构与功能的重要步骤。根据糖链与蛋白质上氨基酸结合方式的不同,可以把糖链分为N-糖链和O-糖链。对于O-糖链的释放主要采用比较成熟的化学方法,如：经典的β-消除法。而对N-糖链的完整释放主要采用酶法,如：N-糖苷酶A (PNGase A)和N-糖苷酶F (PNGase F)。N-糖苷酶F能对大多数的N-糖链进行有效的释放,但对含有核心a1,3-岩藻糖修饰的N-糖链却没有活性；N-糖苷酶A不能作用于完整的糖蛋白,只能作用于糖肽,且酶活效率较低。这两种酶都有各自的局限性,并且价格昂贵,因此发展新的通用性强的N-糖链释放方法对高通量分析及制备均有重要意义。本文研究建立了一套简单、经济、快速的非特异性释放N-糖链的方法,其研究结果如下：1、对于不含核心α1,3-岩藻糖修饰的N-糖链,采用NaOH体系对N-糖链进行完整的释放,糖蛋白样品置于50℃、0.5M NaOH溶液中反应16h。ESI-MS和MS/MS结果表明该方法具有通用性好、释放效率高、无副反应的优点,并且我们成功的用此方法对核糖核酸酶-B、鸡白蛋白、人胎球蛋白和人血浆的N-糖链进行了解析。通过此方法得到的N-糖链都是还原性寡糖,可以标记荧光试剂进行后续的LC、CE及LC-MS/MS分析。2、对于含有核心α1,3-岩藻糖修饰的N-糖链,采用释放并同时标记的策略,糖蛋白样品置于75℃、0.5M NaOH包含0.7M PMP溶液中反应32h。ESI-MS和MS/MS结果表明：PMP极大的抑制了核心a1,3-岩藻糖的降解反应,对植物以及昆虫等含有核心α1,3-岩藻糖的样品具有重要的应用价值。由于PMP带有发色基团,不仅提高了N-糖链在质谱中的检测灵敏度,而且可直接对释放下来的糖链进行LC、CE及LC-MS/MS分析。我们成功的用此方法分析了辣根过氧化物酶、蜂蜜毒液磷脂酶A2、荞麦花粉蛋白、拟南芥叶片蛋白和烟草叶片蛋白的N-糖链。