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新城疫和禽偏肺病分别是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)引起家禽呼吸道感染的急性高度传染性疾病,可在全世界范围内传播,其高发病率和致死率不仅会造成养禽业重大的经济损失,而且还严重威胁着食品安全,公共卫生及生物安全。目前,疫苗接种和严格的生物安全措施是控制NDV和aMPV疾病的主要措施,NDV弱毒株LaSota、B1、VG/GA可作为疫苗直接用于NDV疾病的防控,而aMPV却没有直接用于控制该病爆发的活疫苗弱毒株,现有疫苗的安全性和有效性仍有待于进一步提高。为了研发一种安全有效且经济实用的双价苗,因此,本研究以NDV弱毒株LaSota为疫苗载体,构建表达aMPV抗原蛋白融合蛋白(Fusion protein,F)和糖蛋白(Glycoprotein,G)的重组新城疫病毒,以获得可以抵抗NDV和aMPV的安全有效的双价苗。为了获得表达aMPV C亚型融合蛋白F或糖蛋白G的重组新城疫病毒,该研究以新城疫病毒疫苗株LaSota为载体,首先将绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)作为报告基因插入到NDV基因组F-HN之间,利用反向遗传学技术构建表达GFP蛋白的重组新城疫病毒rLS/GFP。结果显示,LaSota可作为活疫苗载体安全稳定地表达GFP蛋白。进而构建了表达aMPV-C G蛋白的重组新城疫病毒rLS/aMPV-C G,并对其毒力、生物学特性及免疫保护率进行了评估。结果表明rLS/aMPV-C G的毒力在SPF(Specific-pathogen-free,SPF)鸡胚和1日龄雏鸡内轻微致弱,其生物学特性与LaSota株相似,并可完全抵新城疫病毒抗强毒株(NDV/CA02)的攻击,对aMPV-C有部分免疫保护。由此推测G蛋白的抗原性不强,产生的免疫力不足以完全保护aMPV-C的攻击,于是,该研究进一步构建表达aMPV-C双重抗原蛋白F和G的重组新城疫病毒。在rLS/GFP载体的基础上,以红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)为另一报告基因插入到载体F基因末端,作为第二阅读框架,然后将内部核糖体进入位点IRES(Internal ribosome entry site ,IRES)插入F和RFP阅读框架之间用于启动RFP基因的表达,进而成功构建表达两个外源基因(RFP和GFP)的重组新城疫病毒rLS/I-RFP-GFP。在此基础上,构建了表达aMPV-C F和G蛋白的重组新城疫病毒rLS/aMPV-C F G,并对其进行免疫保护评估。结果显示,SPF火鸡免疫接种rLS/aMPV-C F G后可完全保护NDV/CA02的攻击,首免后60-80%的火鸡可诱导产生特异性aMPV-C抗体,二免后可达100%。用强毒aMPV-C攻击时,与对照组LaSota相比,其临床症状表现轻微,病毒在呼吸道内的检出率仅为20%,明显提高了对aMPV的保护率。本研究结果表明,以LaSota为载体表达aMPV-C F和G蛋白的NDV重组疫苗,对NDV/CA02毒株完全保护,对aMPV有明显保护作用,可作为抵抗NDV和aMPV的候选双价疫苗,用于生产实践。同时,在本研究中所构建的重组NDV载体还可用于其他多价疫苗和基因治疗方面的研究,具有广泛的应用前景。