背景小耳和无耳畸形的耳廓修复重建是整形外科医生在临床上要经常面对的难题。软骨组织再生和修复能力差,而采用自体肋软骨或人工材料制备耳廓支架存在供区并发症、取材有限、感染及免疫排斥等诸多问题。3D生物打印是在组织工程发展过程中新兴起的一种分层叠加增材制造技术,能够应用细胞和生物材料按照计算机建立的模型,构建出具有生物学活性的三维组织结构,是耳软骨重建和修复的新的希望。在基于3D生物打印技术构建组织工程软骨的研究中,打印结构中细胞存活、增殖和分化能力以及形成软骨组织的效率是重点关注的问题。脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）因其多向分化能力、易获得、体外扩增速度快和免疫原性低等优点被视为软骨组织工程中优秀的种子细胞。目前,有关人ADSCs应用在3D生物打印构建组织工程软骨的研究较少,尚缺乏其作为种子细胞的不同应用策略的对比研究,因此,在打印结构生物学活性、组织形成效率等关键问题上,仍缺乏有力的证据支持其对于3D生物打印制备再生软骨的适用性。目的1.用人脂肪来源干细胞复合光敏化水凝胶制备“生物墨水”,通过3D生物打印技术体外制备具有生物学活性和三维结构的软骨支架。2.提出以人脂肪来源干细胞作为种子细胞的三种不同种子细胞应用策略（1）单细胞打印（2）与软骨细胞混合打印（3）预先成软骨分化后打印,以单独打印软骨细胞为对照组,对比各种方案的优势和不足,筛选更适合应用于3D生物打印构建组织工程软骨的方案。3.将3D生物打印的细胞-水凝胶复合支架移植于裸鼠皮下体内培养,观察其形成软骨组织的能力和效率,探究此方法制备耳再造软骨支架的可行性。方法1.以人脂肪抽吸术获得的脂肪组织为来源,分离、培养和鉴定人脂肪来源干细胞,并对比观察以平面法、悬滴法和微载体法成软骨诱导培养的人脂肪来源干细胞的分化能力。2.设立实验组1（hADSCs组）、实验组2（hADSCs与软骨细胞共培养组）、实验组3（预分化hADSCs组）和对照组（软骨细胞组）,将细胞复合光敏化水凝胶甲基丙烯酰胺基明胶（Gelatin methacryloyl,GelMA）制备“生物墨水”,采用3D生物打印技术制备细胞-GelMA复合支架。各组支架生物学活性检测:活/死细胞染色检测细胞的存活率,CCK-8法检测细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测细胞的成软骨基因表达。3.将各实验组和对照组打印的含细胞支架移植入裸鼠的背部皮下,8周后取材,观察支架大体形态,通过HE染色、软骨特殊染色（番红O和阿利辛蓝染色）和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察复合支架样本的软骨形成情况。结果1.成功分离提取并鉴定人脂肪来源干细胞,与平面法和悬滴法培养相对比,以微载体进行成软骨诱导分化培养的hADSCs成软骨基因表达最高,可作为3D生物打印预分化hADSCs构建组织工程软骨的细胞来源。2.GelMA水凝胶封装hADSCs以基于微挤压原理的方式进行3D生物打印,可以体外形成三维形态稳定的网格状支架结构。3.打印后一周内,hADSCs与软骨细胞共培养组的细胞存活率和细胞增殖速率最高,hADSCs组和预分化hADSCs组细胞存活率高于对照组,但细胞增殖率低。4.各组成软骨诱导分化培养14天后,hADSCs与软骨细胞共培养组成软骨基因的相对表达量高于hADSCs组,预分化hADSCs组出现软骨肥大标志基因表达。5.3D生物打印的细胞-GelMA水凝胶复合支架移植到裸鼠皮下可以形成软骨组织,hADSCs与软骨细胞共培养组形成软骨组织的效率优于hADSCs组和预分化hADSCs组,与对照组无明显差别。结论基于微挤压原理的3D生物打印的细胞-GelMA复合支架具备稳定的三维结构,移植到裸鼠皮下可以形成软骨组织。hADSCs与软骨细胞共培养组支架在体外实验中细胞存活率、细胞增殖和成软骨基因表达方面均优于对照组、hADSCs组和预分化hADSCs组,在体内实验中形成软骨组织的效率也优于hADSCs组和预分化hADSCs组,与对照组无明显差别,可进一步应用于3D生物打印组织工程软骨的制备。