【摘 要】
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头孢菌素是世界上使用较为广泛的半合成抗生素,在临床使用中多数头孢类抗生素生产的中间体为7-氨基头孢烷酸。7-氨基头孢烷酸主要来自头孢菌素C脱酰作用,主要脱酰方式有化学法、二步酶法和一步酶法。化学脱酰法具有环境不友好且反应条件苛刻等缺点已经被市场淘汰。二步酶法已经基本应用于工业生产,但二步酶法转化率低,反应不易于控制。一步酶法可以直接将头孢菌素C脱酰转化为7-氨基头孢烷酸,具有高转化率、高经济性和环
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头孢菌素是世界上使用较为广泛的半合成抗生素,在临床使用中多数头孢类抗生素生产的中间体为7-氨基头孢烷酸。7-氨基头孢烷酸主要来自头孢菌素C脱酰作用,主要脱酰方式有化学法、二步酶法和一步酶法。化学脱酰法具有环境不友好且反应条件苛刻等缺点已经被市场淘汰。二步酶法已经基本应用于工业生产,但二步酶法转化率低,反应不易于控制。一步酶法可以直接将头孢菌素C脱酰转化为7-氨基头孢烷酸,具有高转化率、高经济性和环境友好性等优点受到了广泛研究。但大自然中存在的头孢菌素C酰化酶活性较低且不稳定,难于工业应用,因此获得一种具有高转化效率的头孢菌素C酰化酶成为解决问题的关键。透明颤菌血红蛋白可以协助氧气进入细胞,使细胞在氧气有限的条件下可以继续生长,有利于代谢产物的积累。利用透明颤菌血红蛋白提高重组菌株的外源蛋白的表达量。ptsG基因是磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统中重要基因,PTS缺陷菌株可以明显的降低葡萄糖的转运速率,平衡细胞内的碳流代谢,进而减少乙酸合成,有利于高密度发酵。因此,ptsG基因的敲除可以有利于重组菌株的生长,增加外源蛋白的表达。实验室前期工作获得碱基GC的含量降低且部分基因突变头孢菌素C酰化酶基因,经过培养基优化后发现酶活达到3.68U/mL,比清华大学将同样来源的头孢菌素C酰化酶经过优化发酵培养基培养后的酶活提高了24%。故在该基因的基础上进行实验具有一定的实验意义。实验成功构建了共表达透明颤菌血红蛋白和头孢菌素C酰化酶的重组菌株pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG（+）BL21（DE3）);pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG（-）BL21（DE3）);pRSFDuet-CA/pACYCDuet-1-vgb(ptsG（+）BL21（DE3）);pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG（-）BL21（DE3）,酶活分别为0.67 U/mL,1.40U/mL,1.1 U/mL,2.1 U。在重组菌株大肠杆菌中,透明颤菌血红蛋白的存在将头孢菌素C酰化酶酶活提高约30%。ptsG（-）的缺失可以使透明颤菌血红蛋白与头孢菌素C酰化酶在大肠杆菌中的共表达酶活提高约1倍。重组菌株在传代10代后,重组菌株酶活存在合理性下降;最适IPTG的诱导浓度为0.05M;培养基的体积比为10%时酶活最高;最适培养基pH为7.5。通过单因素实验确定培养基中最适外加碳源为0.5%甘油,最高酶活重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG（-）BL21（DE3）为3.5U/mL;最适外加氮源为6%牛肉膏,最高酶活重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG（-）BL21（DE3）为6.5 U/mL。对比基因来源所构建的无Vgb基因表达和无ptsG基因缺失的重组菌株,培养基优化后酶活对比提高了77%。实验证明,颤藻血红蛋白可以提高在ptsG基因缺失的情况下,同时表达头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白的可行性,为工业化生产应用提供了一种新的路径。
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