第一部分:小鼠胚胎干细胞体外定向造血分化的研究 目的:ES-D₃细胞是来自129小鼠囊胚内细胞团的具有全能分化潜能的细胞。在合适的体外培养条件下,ES细胞体外可分化为造血干/祖细胞,作为造血干/祖细胞移植的新来源。研究表明,将ES细胞在体外分化为造血细胞的方法主要有两种。一种是利用可溶性细胞因子诱导ES细胞的分化。另一种方法是通过ES细胞与造血基质细胞的相互作用。本实验将两种方法合而为一,探讨体外高效诱导胚胎干细胞生成造血干细胞的方法。 方法:1、ES细胞的培养:为维持ES细胞的未分化特性,将ES细胞系ES-D3培养于PMEF上,培养基为高糖DMEM内含体积分数20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L丙酮酸钠和2 mmol/L谷氨酰胺。2、制备小鼠骨髓基质细胞饲养层BMSC:取6-8周昆明鼠骨髓,经淋巴细胞分离液分离,离心洗涤后,种植于含15%小牛血清的DMEM培养基中。2-3w后MMC处理1-2h,PBS冲洗5遍备用。3、拟胚体（EB）的形成:0.05%胰蛋白酶-0.53mmol EDTA消化生长在PMEF上的细胞克隆,制成单个细胞悬液,按10⁵/ml转入IMDM培养基中（含20%胎牛血清,0.9%甲基纤维素,1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇和2 mmol/L谷氨酰胺）培养4-10天。4、诱导分化造血干细胞及造血祖细胞集落培养:将EB细胞消化分散为单个细胞,转入不同的培养基中,在37℃,5%CO2培养箱中培养7-14天。实验分4组:第一组:自发分化对照组;第二组:细胞因子组（VEGF+SCF+TPO）;第三组:骨