心房颤动(房颤,AF)是最严重的心房电活动紊乱,具有较高的致残率与死亡率,其发病率逐年增高,严重影响了患者的健康状况与生活质量,带来了沉重的社会负担,但发生机制仍不十分明了。早在1995年,就有研究发现心房结构重构与电重构在房颤的发生与维持中具有重要作用。近来,心脏内在自主神经重构,即心脏交感与迷走神经的再生与不均一分布,被证实为房颤的重要发病机制。心脏神经支配主要涉及心脏外在自主神经系统及内在自主神经系统。前者由脑、脊髓与心脏神经丛(GP)之前的神经纤维构成；后者则由心脏表面的神经丛及其神经纤维构成。神经丛实际上是交感与迷走神经末梢在心脏表面的“集散地”,在心脏表面被心脏脂肪垫所包绕,其神经分布比心房的其他部位更加密集。在哺乳动物,心脏主要神经丛均位于肺静脉根部,分别称为上左、下左、前右与下右神经丛。心房以及肺静脉周围的神经重构已有报道,但是神经丛及其周围的神经重构现象以及分子生物学机制还不明了。MicroRNA(miRNA)是生物体内一类较短的内源性非编码小分子RNA,在转录后水平对基因表达进行负调控,参与多种疾病的发病机制,如神经退行性疾病、多种代谢性疾病及心血管系统疾病等。大量证据表明,多种miRNA参与房颤的心房结构重构与电重构的发病过程,并在神经系统疾病的发病中扮演重要角色。研究显示心脏外在自主神经系统有特定的miRNA表达谱,而心脏内在自主神经系统是否有miRNA的不同程度表达,及对房颤的发生与发展有何作用,至今仍无具体研究结论。本研究旨在探讨快速右心房起搏后犬的心脏内在自主神经重构,并从miRNAs的角度研究自主神经的重构的分子机制,为房颤的治疗提供理论依据,主要包括两个部分：第一部分：实验性房颤犬心脏内在自主神经重构及miRNA表达谱的研究研究目的越来越多的证据显示,心脏神经重构为房颤的重要发病机制,但心脏内在自主神经系统,尤其是神经丛的神经重构是否能诱发并维持房颤,以及房颤内在自主神经系统中miRNAs的表达变化及潜在作用机制仍不明了。本实验旨在探讨持续性快速右心房起搏后犬上左神经丛(SLGP)是否发生神经重构,并采用高通量测序方法筛选房颤犬心脏SLGP中明显变化的miRNA,从niRNA的角度揭示心脏内在自主神经重构的分子机制,为房颤的防治提供理论依据。材料与方法1、房颤犬模型制作健康成年杂种犬12只,雌雄不拘,被随机分成两组,分别为对照组与心房快速起搏组(A-TP)。A-TP组以400次／分持续右心房起搏4周。2、心脏电生理指标的检测起搏结束后,开胸,测定左心房后壁上左神经丛附近的心房有效不应期(AERP)。 AERP定义为不引起心房激动的最长S1S2间期。房颤由高频刺激诱发,成功的房颤的诱导定义为持续快速不规则的心房率超过30秒。然后,取左上脂肪垫(LSFP)及其周围<0.5厘米的心房组织。3、免疫组化分析对神经相关分子指标进行免疫组化染色,包括：酪氨酸羟化酶(TH,交感神经的标志物)与乙酰胆碱转移酶(ChAT,副交感神经的标志物),计算对照组与起搏组的神经密度,来反映神经重构现象。4、高通量测序应用Illumina HiSeq二代测序系统对miRNA进行高通量测序,与犬miRNA数据库进行全基因组比较,鉴定犬心脏脂肪垫中miRNA的差异表达。并应用qRT-PCR方法,对测序结果进行验证。结果在右心房快速起搏组中,心房有效不应期明显缩短,TH、ChAT阳性的神经密度均明显上升。对两组进行测序后,总共检测到241种miRNA表达,其中16种miRNAs的表达有显著差异。6种miRNA的表达明显上调,包括miR-206,miR-208b, miR-21, miR-224, miR-451, miR-450b,另10种miRNA的表达明显下调,包括miR-129, miR-138a, miR-34c, miR-7, miR-449, miR-205, miR-203, miR-137, miR-124, miR-202。qRT-PCR结果表明miR-206, miR-224, miR-137与miR-203的差异表达与测序结果相符。结论实验性房颤犬模型中,在心脏上左神经丛部位,发生明显的神经重构现象,高通量测序筛选出多种miRNA的差异表达,差异表的miRNAs可能参与房颤内在自主神经重构。创新性1.应用犬制作快速心房起搏动物模型,并观察犬心脏神经丛的神经重构现象。2.应用高通量测序检测心房快速起搏犬心脏神经丛中miRNAs的表达变化,从miRNA的角度探讨心脏内在自主神经重构。第二部分：MicroRNA-206通过调节SOD1的表达促进房颇心脏自主神经重构的机制研究研究目的先前的研究发现,miR-206在中枢神经系统及外周神经系统均有特异表达,且在神经损伤后促进神经再生,而在心脏内在自主神经系统中的表达及作用还不明了。本实验选取高通量测序右心房快速起搏犬中差异表达明显的miR-206,采用慢病毒感染、免疫组化及多种分子生物学手段,通过体内实验及体外试验来研究miR-206对心脏内在自主神经重构的影响,揭示miR-206对靶基因及其对下游通路的调控机制。材料与方法1、实验分组及慢病毒的感染在动物水平,选取30只杂种犬,随机分为5组。分组如下：1)慢病毒对照组：不起博,在LSFP中感染阴性对照慢病毒2周；2)起搏组(n=6),快速右房起搏后,犬心脏LSFP内注射阴性对照慢病毒2周；3)A-TP+miR-206过表达组：起博4周后,在LSFP中感染miR-206过表达的慢病毒2周;4)A-TP+miR-206沉默组：起博4周后,在LSFP中感染miR-206沉默的慢病毒2周；5)miR-206过表达组：不起博,仅在犬的LSFP中感染miR-206过表达的慢病毒2周。在细胞水平,分离对照组犬心房LSFP及其附近0.5厘米内的心肌细胞,应用辅加10%的胎牛血清与双抗的DMEM进行原代心肌细胞培养。miR-206过表达、沉默及超氧化物歧化酶(SOD1)基因沉默的慢病毒分别感染各组细胞48小时,阴性对照慢病毒感染对照慢病毒组。2、AERP的检测及房颤的诱导通过多通道程序刺激仪分别对照组、起搏组、起搏+感染组进行电生理检查,测定左心房LSFP附近的AERP。应用高频刺激诱导房颤。3、免疫组化分析与Western Blot对神经相关分子指标进行免疫组化染色,包括：蛋白基因产物9.5(PGP9.5,神经元及神经纤维生长的标记物)、TH与ChAT,计算交感与迷走神经的密度。应用Western Blot方法检测SOD1与GAPDH的蛋白表达水平。4、荧光素酶分析报告构建预测的靶基因SOD1的3’-UTR端野生型及miR-206的结合位点缺失型荧光素酶载体。用双荧光素报告分析系统来检测荧光素酶活性,用于验证SOD1基因为miR-206的靶基因。5、ROS的检测应用活性氧(ROS)敏感的2’,7’-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCF-DA)检测细胞中ROS的水平。DCF荧光的水平可反映ROS的浓度。在动物组织中,在488nm的可见光下检测DCF的荧光水平。6、miR-206下游基因的芯片分析取感染miR-206的过表达组与阴性对照组的组织标本,应用表达谱芯片进行筛选miR-206的下游基因,并行GO分析以及KEGG通路分析来定义下游基因的生物学功能。应用qRT-PCR方法来验证分析结果。结果1、miR-206的表达上调促进心脏内在自主神经重构并易化房颤的发生(1)A-TP组犬的AERP明显缩短,而A-TP基础上miR-206的表达上调进一步使AERP缩短,并使房颤的诱发性增加,而沉默miR-206使AERP延长。(2)miR-206的过表达与A-TP均使PGP9.5、TH、ChAT阳性的神经密度明显上升,而miR-206的表达下降使以上神经密度明显下降。(3)miR-206的过表达会引起pGL3-SOD1-UTR-野生型细胞荧光素酶活性的显著降低,SOD1基因的3’UTR区的缺失可以抑制上述荧光素酶活性的降低,说明SOD1的3’UTR区域中包含miR-206的结合位点。验证了SOD1是miR-206的靶基因。(4)动物实验显示miR-206的过表达可减少SOD1的表达至对照组的48%,A-TP组中SOD1的表达降至对照组的39%,而A-TP后的miR-206的表达上调使SOD1下降至A-TP组的34%,说明miR-206负调控SOD1。(5)体外实验中,miR-206的过表达使ROS水平增加了近2倍,miR-206的沉默明显降低了ROS水平至对照组的50%。动物实验中,获得了相似的结果,miR-206过表达的犬中ROS水平上升至1.6倍,A-TP组中ROS水平也有明显增加,A-TP后miR-206过表达使ROS水平增加更明显。通过沉默SOD1基因,ROS水平上升至1.4倍,且miR-206沉默介导的ROS水平的下降可被SOD1基因的沉默逆转。验证了miR-206通过调节SOD1的表达来调控ROS的水平。2、miR-206调节下游多种mRNA的表达芯片分析显示miR-206过表达后,有1254种mRNA显示表达差异2倍以上。GO分析及KEGG通路分析表明这些mRNA涉及到神经系统以及心血管系统等多条信号通路,显示miR-206通过多条信号通路影响心脏自主神经重构过程。结论在房颤的自主神经重构过程中,miR-206通过促进心脏内在自主神经重构进而影响心脏电生理特性的改变来诱发房颤。其潜在的机制可能与miR-206调节靶基因SODl的表达,后者进一步增加ROS水平以及调控多条下游信号通路有关。创新性1.制作快速心房起搏犬模型,并检测miR-206在心脏神经丛中的表达变化及对神经重构的影响；2.心脏脂肪垫内活体注射miR-206过表达及沉默慢病毒,研究miR-206通过调控靶基因SOD1及下游信号通路来影响心脏自主神经重构的作用机制。