自从上世纪70年代初Folkman提出肿瘤的生长具有血管依赖性，抗肿瘤血管治疗已成为恶性肿瘤治疗的一个颇具前景的手段。最初认为抗肿瘤血管治疗可以阻断肿瘤的营养供应，使得肿瘤缺血、缺氧从而达到抑制肿瘤生长的目的。然而临床研究发现单纯抗肿瘤血管治疗的疗效并不确定，但是将其与化疗或放疗序贯地联合应用，可以明显提高临床疗效。矛盾的是，肿瘤在缺血、缺氧的条件下对放疗或化疗的敏感性应该下降。所以原先提出的抗肿瘤血管治疗的机理受到质疑。　　随着对肿瘤血管生成机制认识的加深，目前已认识到异常的肿瘤血管及肿瘤微环境是促血管生成因子和血管生成抑制因子平衡发生偏斜的结果。抗肿瘤血管治疗可以:①、使得肿瘤微环境促血管生成因子和血管生成抑制因子恢复平衡，从而肿瘤血管及其微环境发生暂时的正常化(normalization);②、抗肿瘤血管药物选择性作用于未成熟的微血管，治疗后残留较为成熟的血管，即血管相对正常化;③、抗肿瘤血管药物调节血管发育过程中相关分子的表达，如G蛋白信号通路调节蛋白5（regulator of G-protein signaling5，RGS5），促进肿瘤血管发育成熟。肿瘤血管和微环境相对正常的状态下，抗转移的能力增强，肿瘤细胞的供血、供氧增加，并且对放化疗的敏感性增强。肿瘤血管及其微环境发生正常化在临床上有重大意义，提升了抗肿瘤血管治疗的临床地位，为制定更合理的抗肿瘤治疗方案提供理论依据。　　抗血管药物引起肿瘤血管正常化这一现象的提出和验证目前主要集中于抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其下游信号通路的分子靶向药物。因为目前所有的抗肿瘤血管生成的药物均能直接或间接抑制VEGF的作用，推测肿瘤血管及微环境正常化是肿瘤抗血管治疗的普遍现象。为验证这一猜测，本实验观察重组人血管内皮抑素（rh-endostatin，内源性血管生成抑制因子）和小剂量化疗（metronomic chemotherapy，节拍化疗）对肿瘤血管及微环境的调节，同时初步探索了RGS5在非小细胞肺癌中的表达及对肿瘤转移的影响。　　第一部分　　肿瘤血管和肿瘤转移的抑制效果与肿瘤生长的抑制效果之间的关系　　目的:观察重组人血管内皮抑素及小剂量环磷酰胺对小鼠Lewis肺癌及A549肺腺癌抑制肿瘤血管或抑制肿瘤转移效果与抑制肿瘤生长之间的关系。　　方法:建立小鼠Lewis肺癌及A549肺腺癌皮下移植瘤模型，给予重组人血管内皮抑素（5mg/kg/d，皮下注射，Lewis肺癌7天，A549肺腺癌14天）或小剂量环磷酰胺（约15mg/kg/d，口服，连续28天）治疗，以生理盐水做对照。监测肿瘤体积的变化。通过动态增强磁共振(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)、荧光素示踪法、微血管密度计数（免疫组化）等方法观察重组人血管内皮抑素的肿瘤血管抑制效果，通过观察脏器转移结节比较小剂量环磷酰胺抑制肿瘤转移的效果。　　结果:小鼠Lewis肺癌给予重组人血管内皮抑素治疗7天后，DCE-MRI显示肿瘤增强不明显、肿瘤内部坏死区明显增加，微血管密度明显下降(P=0.034)，而裸鼠A549肺腺癌移植瘤荧光素(TRITC-Dextran)低弥散面积明显增加（16.85％±2.01％ vs.1.49％±0.57％，P＜0.01）。但开始治疗14天后，小鼠Lewis肺癌微血管密度明显增加，甚至超过对照组，裸鼠A549肺腺癌中荧光素低弥散面积也明显减少（0.82％±0.21％ vs.10.01％±2.01％，P＜0.01）。小鼠Lewis肺癌给予小剂量环磷酰胺治疗后，小鼠肝脏转移结节数明显减少(0±0 vs.8±2，P=0.002）。但小鼠Lewis肺癌和裸鼠A549肺腺癌的生长均未被重组人血管内皮抑素所抑制，试验终止时两种模型的治疗组和对照组肿瘤体积分别是:1725.2±553.53mm3 vs.1701.8±525.62mm3;763.92±281.85mm3 vs.693.91±186.80mm3。同样，小剂量环磷酰胺也不能明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长。　　结论:低剂量重组人血管内皮抑素的抗肿瘤血管疗效及小剂量环磷酰胺的肿瘤转移抑制效果与其对肿瘤生长的抑制效果存在不一致性，两者能明显抑制小鼠Lewis肺癌及A549肺腺癌的微血管生成或肿瘤转移，但却不能抑制局部肿瘤的生长。　　第二部分　　重组人血管内皮抑素和小剂量紫杉醇对肿瘤微血管及微环境的调节作用　　目的:观察重组人血管内皮抑素及小剂量紫杉醇对Lewis肺癌和A549肺腺癌微血管及微环境的调节作用。　　方法:建立小鼠Lewis肺癌及A549肺腺癌皮下移植瘤模型，给予重组人血管内皮抑素（5mg/kg/d，皮下注射，Lewis肺癌7天，A549肺腺癌14天）治疗。小鼠Lewis肺癌分别于治疗后第3天、第6天、第9天三个时间点取肿瘤检测微血管密度（免疫组化）、肿瘤微血管胶原（Masson染色）、肿瘤乏氧情况（乏氧探针联合免疫组化）、VEGF、血栓反应素(Thrombospodin-1，TSP-1)、RGS5、血小板/内皮细胞黏附分子（platelet/endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）的表达(RT-PCR)。裸鼠A549肺腺癌分别治疗后第7天、第14天、第21天三个时间点取肿瘤，荧光素（TRITC-Dextran）示踪法检测肿瘤血液弥散情况。随后，小鼠Lewis肺癌在重组人血管内皮抑素治疗的不同时间段（第0天到第2天、第3天到第5天、第6天到第8天）联合紫杉醇（20mg/kg/d，腹腔注射），监测肿瘤生长曲线。另建立小鼠Lewis肺癌，给予不同剂量频率的紫杉醇（总剂量相同约40mg/kg，2mg/kg每天;6mg/kg每3天;20mg/kg每10天，腹腔注射），记录肿瘤生长曲线，治疗结束后，伊凡氏蓝萃取试验检测各组肿瘤血管的通透性。　　结果:重组人血管内皮抑素治疗小鼠Lewis肺癌后的第3天、第6天、第9天肿瘤微血管密度均比对照组低，但到第9天最明显(P＜0.05)。而第6天肿瘤乏氧面积明显减少(P＜0.05)且胶原结构较多的微血管在第6天也明显增多(P＜0.01)。重组人血管内皮抑素治疗小鼠Lewis肺癌3天后，肿瘤TSP-1 mRNA水平明显上调(P＜0.01)，但随后的时间点维持在较低水平，而VEGF mRNA表达在三个时间点均较高。RGS5的转录在第6天明显上调（P＜0.01），同时代表肿瘤血管内皮细胞周细胞覆盖率的RGS5与PECAM-1的比值在治疗第6天后有较明显的升高(P＜0.05)。A549肺腺癌给予生理盐水处理14天后，肿瘤内部血液弥散相对于第7天和第21天显著减少（低弥散面积占总面积分别为10.01±4.50％、1.49±1.14％和2.90±2.02％）。而重组人内皮抑素能够在治疗的第7天明显抑制肿瘤的血液弥散（低弥散面积占总面积的16.85±4.03％），但第14天后这种抑制作用解除，肿瘤内部血液弥散反而增加（0.54±0.32％，P=0.000），到第21天时则两组没有明显差别。与对照组相比，重组人内皮抑素处理后第3天开始联合紫杉醇除了未见明显毒性增加，肿瘤的生长也较缓慢。每10天给予紫杉醇20mg/kg能够明显降低单位Lewis肺癌伊凡氏蓝含量，尽管此时肿瘤未见明显缩小。而每3天给予紫杉醇6mg/kg也能减少单位肿瘤伊凡氏蓝含量，但能力较弱。每天给予紫杉醇2mg/kg能较好地抑制肿瘤生长，但不能降低肿瘤血管的通透性。　　结论:重组人血管内皮抑素能够一段时间内改善小鼠Lewis肺癌及A549肺腺癌血管成熟度，减轻肿瘤乏氧情况或增强肿瘤血液的弥散，并且在此时间段能够提高小鼠Lewis肺癌的化疗敏感性。重组人血管内皮抑素产生这一作用的分子机制可能与TSP-1或RGS5的短暂上调的有关。同时以适当的模式给予化疗药也能改善肿瘤微血管的功能。　　第三部分　　RGS5在非小细胞肺癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性　　目的:RGS5的表达与肿瘤血管的发育相关，而成熟的肿瘤血管能够抑制肿瘤的转移。我们推测肿瘤中RGS5的表达与肿瘤转移密切相关。本部分即为验证这一猜想，观察RGS5在非小细胞肺癌中的表达及其与淋巴结转移的相关性。　　方法:GeneBank检索RGS5(Accession No.NC_000001)基因完整序列，MethPrimer分析启动子区域CpG岛的位置并设计甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)引物。收集59例非小细胞肺癌石蜡包埋标本，其中31例有新鲜肿瘤和癌旁正常肺组织。新鲜组织提取总DNA及总RNA，检测RGS5 mRNA的表达水平和启动子区域甲基化状态，并分析两者之间的相关性。免疫组化检测石蜡标本中RGS5的蛋白表达水平，并分析RGS5表达与肿瘤淋巴结转移的关系。部分病人术后随访，并分析RGS5的表达水平与非小细胞肺癌病人无进展生存期（progression freesurvival，PFS)的关系。　　结果:59例非小细胞肺癌标本中有21例高表达RGS5(36％)。RGS5基因启动子区域的高甲基化与RGS5 mRNA的低表达相关。RGS5的高表达与肿瘤的淋巴结转移呈负相关，同时高表达RGS5的病人的无进展生存期较长(15.0 months(95％CI:10.8-19.2) vs.9.0months(95％CI:5.0-13.0)。　　结论:启动子区域的甲基化参与RGS5基因表达的调控，而RGS5在肿瘤的转移过程中可能起比较重要的作用。另外，RGS5可能是非小细胞肺癌病人无进展生存期的一个预测因子。