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乳腺癌是全球女性最高发的癌症,也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。临床治疗乳腺癌的主要策略包括手术联合放化疗,多数患者在治疗后有一定的好转,但随着化疗药物的广泛应用,患者产生了耐药性。紫杉醇（Paclitaxel,Taxol）是乳腺癌患者最广泛使用的化学治疗剂之一,随着耐药性的产生降低了治疗有效性。因此,迫切需要探索药物潜在抗性的分子机制,增强乳腺癌患者对化疗药物的敏感性。乳腺癌是一种异质性疾病,具有广泛的基因突变和染色体异常,乳腺癌的发生发展涉及遗传和表观遗传学。后者包括DNA甲基化、染色体重构、非编码RNA调控和组蛋白修饰等,其中DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰。研究发现,DNA甲基化造成大多数肿瘤细胞抑癌基因沉默或/和癌基因激活,干扰肿瘤细胞死亡。而且,异常的DNA甲基化不仅参与人类癌症的发生,而且与化疗药物耐药有关。化疗药物可以通过诱导高表达GSDME的肿瘤细胞发生焦亡,改善其治疗效果。因此,靶向GSDME介导的焦亡可能会提高癌细胞的化疗敏感性。5-氮杂-2-脱氧胞苷（地西他滨）是DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂,在细胞周期的S期进入DNA,改变表观遗传模式,进而影响基因表达。有研究发现,地西他滨可以改善肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性,目前在临床上已用于治疗骨髓增生异常综合征（MDS）和血液系统恶性肿瘤。因此,通过地西他滨进行表观遗传治疗可能是治疗癌症的一种有前途的策略。细胞焦亡是Gasdermin家族介导的程序性细胞死亡。近年来,该家族成员之一GSDME成为肿瘤学研究的焦点。化疗药物使高表达GSDME蛋白的肿瘤细胞发生焦亡,使低表达GSDME蛋白的肿瘤细胞发生凋亡。在癌细胞的杀伤方面,细胞焦亡比细胞凋亡更具破坏性。因此,GSDME表达的丧失可能会引起癌细胞对化疗药物的抵抗。本研究以人乳腺癌敏感细胞MCF-7为研究对象,采用低浓度梯度诱导法构建乳腺癌耐紫杉醇细胞MCF-7/Taxol,对比两种细胞焦亡关键基因GSDME的表达与表观遗传变化的关系,研究DNA甲基化是否通过影响GSDME表达,影响MCF-7/Taxol细胞对Taxol的化疗敏感性。目的探讨MCF-7/Taxol细胞中DNA甲基化调控GSDME表达及与化疗耐药的关系。材料与方法1研究对象乳腺癌敏感细胞MCF-7购自美国典型培养物保藏中心（ATCC,USA）,乳腺癌耐紫杉醇细胞MCF-7/Taxol是本研究组采用Taxol低浓度梯度诱导法构建,体外测定之前,将MCF-7/Taxol细胞在无药培养基中培养两周。细胞处理好后置于无菌、37℃、5%CO2培养箱中培养。2方法2.1耐药细胞株的构建:将生长良好的MCF-7细胞接种在培养瓶中,12h细胞贴壁后,从培养箱取出培养瓶,加入Taxol,以1.60 nmol·L-1Taxol为起始加药浓度,细胞稳定生长后,以1.5倍梯度浓度Taxol递增加药,最终使MCF-7/Taxol细胞在含86 nmol·L-1 Taxol的培养基中稳定生长。2.2实验分组:（1）MCF-7组（敏感细胞）和MCF-7/Taxol组（耐药细胞）:检测耐药细胞构建是否成功、检测焦亡关键基因GSDME表达量、检测细胞全基因组甲基化位点及水平。（2）MCF-7组（敏感细胞）、MCF-7/Taxol组（耐药细胞）和MCF-7/Taxol+地西他滨处理组（地西他滨处理组细胞）:检测GSDME去甲基化对Taxol敏感性、细胞焦亡和生物学功能的影响。2.3 CCK-8实验:检测MCF-7/Taxol对Taxol的敏感性分析;检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞对Taxol的敏感性。2.4 qRT-PCR实验:检测敏感细胞和耐药细胞耐药基因ABCB1和焦亡关键蛋白GSDME的m RNA表达量。2.5 Western Blot实验:检测敏感细胞和耐药细胞PGP和GSDME蛋白表达量;检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞GSDME-N活性片段的表达量。2.6 Me DIP-seq实验:检测敏感细胞和耐药细胞全基因组甲基化位点和水平。2.7 LDH释放实验:检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞LDH释放量。2.8流式细胞术:检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞,Taxol作用下细胞焦亡的发生情况。2.9平板克隆形成实验:检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞的细胞集落形成能力。2.10细胞划痕愈合实验:检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞的细胞迁移能力。2.11 Transwell实验:检测敏感细胞、耐药细胞和地西他滨处理组细胞的细胞侵袭能力。3统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示,两组间定量资料比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以α=0.05作为检验水准。结果1乳腺癌耐紫杉醇细胞株MCF-7/Taxol对Taxol高度耐药与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞对Taxol的耐药指数显著增高（P≤0.001）;与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞耐药基因ABCB1及其表达的PGP蛋白量显著增加（P≤0.001）。2 GSDME在MCF-7/Taxol细胞中的表达受表观遗传机制的调控与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞焦亡关键基因GSDME表达量显著降低（P≤0.01）;两种细胞具有不同的甲基化模式,与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞增强子区GSDME甲基化程度显著增加（P≤0.05）;与MCF-7/Taxol细胞相比,地西他滨处理组细胞GSDME表达量显著增加（P≤0.001）。3 Taxol诱导MCF-7细胞和地西他滨处理的MCF-7/Taxol细胞发生焦亡Taxol处理细胞24 h后,与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞的LDH释放量、焦亡发生率及GSDME-N活性片段的表达量均显著降低（P≤0.001）;与MCF-7/Taxol细胞相比,地西他滨处理组细胞的LDH释放量、焦亡发生率及GSDME-N活性片段的表达量均显著增加（P≤0.001）。结果表明,Taxol使MCF-7细胞和地西他滨处理组细胞发生焦亡,且细胞焦亡与GSDME-N的表达量有关。4地西他滨和Taxol联合处理增强MCF-7/Taxol细胞的化疗敏感性与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞在Taxol处理下的细胞生长抑制率显著降低（P≤0.001）,且细胞对Taxol的IC50值显著增加（P≤0.001）;使用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理MCF-7/Taxol细胞后,与MCF-7/Taxol细胞相比,地西他滨处理组细胞在Taxol处理下的细胞生长抑制率显著增加（P≤0.001）,且细胞对Taxol的IC50值显著降低（P≤0.001）。以上结果表明,地西他滨和Taxol联合处理可以增强MCF-7/Taxol细胞的化疗敏感性。5地西他滨处理改变MCF-7/Taxol细胞的生物学功能与MCF-7细胞相比,MCF-7/Taxol细胞的集落形成能力、迁移能力及侵袭能力显著增加（P≤0.001）;与MCF-7/Taxol细胞相比,地西他滨处理组细胞的集落形成能力、迁移能力及侵袭能力显著降低（P≤0.001）。以上结果表明,地西他滨作用下MCF-7/Taxol细胞的生物学功能发生改变。结论采用低浓度梯度诱导法构建乳腺癌耐紫杉醇细胞株MCF-7/Taxol,并鉴定其为高度耐药模型。乳腺癌敏感细胞MCF-7高表达GSDME,Taxol处理下以细胞焦亡的方式死亡;乳腺癌耐药细胞MCF-7/Taxol由于DNA甲基化降低GSDME表达,细胞焦亡发生受抑,对Taxol表现出耐药性;脱甲基剂地西他滨处理耐药细胞增加GSDME表达,诱导细胞焦亡从而提高细胞对Taxol的敏感性。联合使用地西他滨和Taxol的治疗策略可能是克服MCF-7/Taxol细胞对Taxol耐药的新方法。