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林木木材性状的改良是树木遗传改良的重要组成部分,目前对林木木材性状调控机理的研究已成为树木分子生物学研究的热点。美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)具有速生、丰产、木材品质优良等优点,前期研究发现成年美洲黑杨树木主干不同高度处基因的表达量与木材密度、微纤丝角大小等木材性状指标存在差异,由此建立了未成熟木质部c DNA表达芯片。通过芯片研究发现,小GTP结合蛋白基因Pd RAN、膜结合蛋白基因Pd REM、扩展蛋白Pd EXT和细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB,这四个基因与材性指标木材密度和微纤丝角密切相关。通过RT-PCR方法对这四个材性候选基因进行了分离,并进行基因功能分析和验证,初步阐明了这些基因的材性功能和可能的分子作用机理,进而为培育速生丰产、具备优良材性价值和用途的杨树新品种奠定基础。获得的主要研究结果如下:1.首次从杨树中克隆与木材性状相关小GTP结合蛋白基因Pd RAN。该基因编码区全长为666bp,可编码221个氨基酸残基的蛋白质。基因表达模式研究发现,Pd RAN在叶芽中的表达量尤其高,在未成熟木质部、未成熟韧皮部、叶片、韧皮部、花芽依次降低,而木质部中检测到的Pd RAN基因表达量最低。亚细胞定位研究表明Pd RAN蛋白定位在细胞核。为进一步研究Pd RAN基因在材性方面的功能,构建了该基因的正、反义和RNAi表达载体,并利用农杆菌介导的叶盘法将其导入杨树和烟草中,花序浸染法将其导入拟南芥。PCR检测和Southern杂交实验显示,Pd RAN基因已整合到受体杨树基因组中。荧光实时定量PCR分析表明转基因植株目标基因的转录水平发生了改变。山新杨株系的表型观察发现,Pd RAN正义转化植株分支增多,而反义转基因植株则促进生长和加粗。相比对照野生型拟南芥,转Pd RAN基因正义表达载体拟南芥植株茎粗叶茂,高度增加,生殖期推迟。对转基因山新杨茎横切面进行组织切片研究发现,Pd RAN正义转基因植株木质部区域明显变窄,反义转化植株木质部明显变宽,韧皮部的变化趋势与木质部大致相似,由此可初步推测Pd RAN可能作为负调控因子参与木材的发育和品质的形成。Pd RAN基因正义转化植株的微纤丝角变小,有利于木材品质的改良。2.首次从杨树中分离与木材性状相关的膜结合蛋白基因Pd REM。该基因编码区全长612bp,编码蛋白具有203个氨基酸。基因枪法研究表明,EGFP-Pd REM融合蛋白定位在细胞膜。Pd REM基因的组织时空表达研究发现,Pd REM特异在美洲黑杨叶芽、未成熟木质部和韧皮部有较高水平的表达量,其次在木质部、韧皮部、未成熟韧皮部有一定的表达水平,而花芽中检测到的Pd REM基因表达量最低。构建Pd REM基因的正反义表达载体,遗传转化山新杨、烟草,通过花序浸染法将表达载体遗传转化到拟南芥中。定量RT-PCR研究表明,正、反义Pd REM表达载体改变了转基因植株靶基因的转录水平。Pd REM反义转化的杨树植株比对照茎部粗壮,地径增大,叶片数增多,转Pd REM正义表达载体的杨树植株比对照非转基因植株矮小,茎干变细,地径变小。转Pd REM基因正义表达载体拟南芥植株粗壮,开花期延后。切片观察发现,Pd REM反义转化杨树植株木质部区域相比对照明显变宽,而正义转化植株木质部区域明显变窄,表明Pd REM可能是一个负调控因子。Pd REM正反义转化植株相比对照植株微纤丝角均变小,初步判断该基因在转基因微纤丝角的改良中起作用。3.首次从美洲黑杨未成熟木质部中分离与木材性状相关的扩展蛋白基因Pd EXT。该基因编码区长为423bp,Pd EXT蛋白有140个氨基酸。利用维管组织特异启动子pro NAC068载体,成功构建了美洲黑杨Pd EXT基因的正反义表达载体。运用农杆菌侵染法,将携带有目标基因载体的GV3101农杆菌侵染84k银腺杨叶片,通过花序浸染法将表达载体遗传转化到拟南芥。PCR检测表明获得Pd EXT基因正反义银腺杨转化植株。转Pd EXT基因正义表达载体拟南芥植株相比对照叶片保持鲜绿,茎枝条粗壮,花期延后,株型搭配合理。4.细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB的功能验证。利用RT-PCR技术研究了美洲黑杨材性相关候选基因细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB的表达谱,结果显示在未成熟木质部、未成熟韧皮部、韧皮部中Pd CYTOB基因具有较高水平的表达量。对导入反义Pd CYTOB的山新杨植株进行Southern杂交和RT-PCR检测,证实Pd CYTOB基因已整合到杨树基因组中并表达。对大田转基因株系及对照植株进行表型观察、组织切片和微纤丝角的测定。结果表明,Pd CYTOB反义转化植株高度明显增加,木质部、韧皮部有所变宽。转Pd CYTOB基因植株的微纤丝角明显变小,初步表明转基因杨树在造纸性能上有所改良。这对于阐明Pd CYTOB在美洲黑杨木材形成中的分子作用机制有重要的理论意义。