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背景与目的:小肠作为消化系统的重要组成部分,是进行食物消化和营养吸收的主要器官。小肠壁的内表面有许多绒毛状的突起,叫小肠绒毛。小肠绒毛四周的凹陷结构,叫隐窝。小肠上皮细胞覆盖整个肠道内表面,包括干细胞、吸收型上皮细胞、内分泌细胞、潘氏细胞和杯状细胞等类型。小肠干细胞位于隐窝底部。正常生理状态下,小肠干细胞可不断增殖,并沿着隐窝-绒毛轴向上迁移并分化为各种类型的终末分化细胞,维持小肠上皮的不断更新。在病理状态下,小肠干细胞增殖是修复损伤上皮的一个重要机制,小肠上皮损伤能够刺激小肠干细胞分裂分化加速,帮助修复上皮损伤部位。Interleukin-22(IL-22)是一种由Th17、Th22、NK细胞等多种免疫细胞分泌的细胞因子,可特异地作用于消化道、呼吸道上皮细胞和皮肤表皮细胞,调控上皮/表皮细胞的功能。在肠上皮细胞中,IL-22既能够保护和修复上皮损伤,又能够促进炎症反应。IL-22在葡聚糖硫酸酯钠(DSS)小鼠模型中诱导的结肠炎中发挥重要作用。然而IL-22究竟是抑制还是促进DSS诱导的结肠炎还存在争论,IL-22是否影响小肠干细胞的干性和分化也尚未明确。本研究主要采用小肠类器官(enteroids)体外培养模型,旨在探索IL-22对小肠干细胞干性和分化的影响,并深入研究IL-22调节炎症性肠病的作用机制。研究方法:建立小肠上皮细胞的体外3D培养技术。新鲜分离出小肠隐窝,悬浮于富含层黏素的基质胶中,并在培养液中加入生长因子EGF、Noggin和R-Spondin,可形成立体的小肠类器官(enteroids)。IL-22处理过的类器官作为实验组,PBS处理作为对照组。采用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)细胞染色观察死亡细胞的数量;EdU(5-Ethynyl-2-deoxyuridine)染色用于检测细胞增殖情况;CellEventTM Caspase-3/7染色鉴定IL-22引起的细胞死亡是否为凋亡;收集实验组和对照组的类器官,提取mRNA并逆转录获得cDNA,运用Real-Time qPCR检测干细胞标记基因、各种类型上皮细胞标记基因、Wnt信号、Notch信号相关基因等在转录水平的表达情况;使用JAK-STAT3信号的抑制剂处理小肠类器官,以证实相关信号通路发挥的作用。B6小鼠腹腔连续7天注射IL-22,PBS注射组作为对照组。观察小鼠大体情况;取小肠和结肠段,石蜡包埋、切片后进行HE染色,观察肠上皮形态变化和炎症情况;采用EdU染色和PCNA抗体免疫组化,检测上皮细胞增殖情况;Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠腹腔连续7天注射IL-22后,培养小肠类器官,观察类器官Lgr5-EGFP+的干细胞的数量和荧光强度。结果:和对照组相比,IL-22处理后,小肠类器官形态异常,数量减少。尽管EdU检测显示IL-22短暂处理后的类器官增殖细胞数量增加,但PI染色发现IL-22长时间处理后的类器官坏死细胞大量增加。CellEventTM Caspase-3/7染色进一步揭示IL-22加速类器官细胞的增殖的同时也增加了凋亡细胞的产生。Real-Time qPCR结果显示IL-22处理组Lgr5、Asc12、Oflm4等干性基因表达显著下降。吸收型上皮细胞标记分子Alpi和Villin的表达也显著下降。JAK-STAT3通路抑制剂能够缓解IL-22引起的类器官细胞的凋亡。Notch信号通路相关基因包括Jagl、Dlll、Notch1、Hesl等表达也显著降低。注射IL-22的小鼠小肠长度无明显变化,石蜡切片/HE染色显示小肠上皮结构受到破坏,小肠隐窝数量明显减少。从注射IL-22的Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2小鼠中培养小肠类器官,发现类器官的Lgr5-EGFP+干细胞数量明显减少,绿色荧光信号减弱。结论:在小肠类器官模型中,IL-22短暂处理可促进小肠上皮细胞的增殖,但IL-22长时间处理可导致Lgr5+的小肠干细胞干性丧失、数量减少。在小鼠体内,IL-22可引起小鼠小肠上皮结构损伤,肠上皮细胞增殖活性减弱,小肠隐窝形态改变和数目减少。IL-22可能通过JAK-STAT3抑制Notch信号,降低Lgr5+的小肠干细胞的干性,并且抑制祖细胞分化为成熟的吸收型上皮细胞。因此,IL-22的一过性表达可能促进小肠上皮损伤修复,而IL-22长时程高表达可导致Lgr5+干细胞的干性下降、分化异常,将不利于小肠上皮的自我更新和损伤修复。