背景与目的:骨缺损性疾病是一类严重影响人们生活质量甚至威胁生命的疾病,血管再生和血液循环的重建在骨科中的骨缺损和骨折的愈合、糖尿病足患者下肢血液重建和愈合、股骨头缺血性坏死的预防和治疗中都有重要意义。血管再生是治疗此类疾病的关键。再生医学和组织工程的发展为这类疾病的治疗和康复提供了新的方法和思路,选取种子细胞移植促进血管新生是重要思路之一。其中骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）可成为种子细胞的候选对象之一。目前关于间充质干细胞向内皮细胞分化的研究,多采用细胞因子进行诱导分化或细胞的共培养的方法进行诱导分化,本课题采用细胞共培养的方法进行诱导。热休克方法是组织工程中一种细胞处理方法,已在干细胞分化领域有过重要进展,热休克处理的内皮细胞可以诱导间充质干细胞向内皮细胞分化尚未见报道。骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的过程受多种因素调节,其中Notch信号通路在细胞分化和缺血性疾病状态下诱导的新生血管生成过程中扮演重要角色。本课题研究主要包括观察和探究热休克处理的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的能力和可行性,并观察诱导骨髓间充质干细胞形成血管的能力,以及研究在这个分化过程中Notch信号的作用。方法:1、提取和培养人骨髓来源的间充质干细胞,增值传代至第三代（P3）,选用第三代（P3）至第七代（P7）的细胞作为研究用细胞,观察显微镜下细胞形态,使用流式细胞仪鉴定细胞表面CD90,CD105,CD34,CD14,CD31,CD45,CD144,VEGFR2,v WF免疫表型的表达情况。2、验证提取骨髓间充质干细胞的分化能力,分别使用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基诱导间充质干细胞成骨和成脂肪的分化,验证间充质干细胞的成骨和成脂分化能力,成骨分化能力使用茜素红染色和细胞碱性磷酸酶活性测定,成脂分化能力使用油红O染色验证。3、提取和培养人脐静脉内皮细胞,增值传代,使用第二代（P2）至第六代（P6）的细胞作为实验用细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态,使用流式细胞仪分析检测细胞表面CD105,CD144,CD31,CD34,VEGFR2,v WF,CD14,CD45免疫标志物的表达情况。4、对人脐静脉内皮细胞进行热休克处理,将从培养瓶中消化下来的人脐静脉内皮细胞置于离心管中,然后置于40～42℃水浴里1小时,将热休克后的人脐静脉内皮细胞和骨髓来源间充质干细胞进行细胞共培养,采取Transwell培养板非接触共培养模式进行细胞诱导分化,置入细胞培养箱中培养7天和14天。细胞诱导分化7天和14天后,提取细胞进行流式细胞仪检测,检测细胞免疫表型抗原CD31,CD144,VEGFR2,v WF的表达情况,对诱导分化结果进行初步验证。5、取未诱导的细胞、诱导7天和诱导14天后的细胞,使用细胞免疫荧光对CD31,CD144,VEGFR2,v WF,UEA-1免疫抗原进行检测,在荧光显微镜下观察结果,并使用计算机软件分析累计光密度值（IOD值）。6、提取未诱导分化的细胞作为对照组,和细胞分化诱导7天和14天后的细胞,接种于Matrigel基质胶上进行体外Matrigel成血管实验,接种后的细胞放入细胞培养箱中24小时,在倒置相差显微镜下观察成血管结果,用计算机软件计算和统计显微镜下血管长度,分析体外血管形成的能力。7、取诱导7天和14天的人骨髓间充质干细胞、未诱导的人骨髓间充质干细胞（对照组）分别重悬在Matrigel基质胶中,计算和调整各组细胞密度确保各组细胞密度相等,注射到裸鼠背部皮下进行异体移植。14天后,取出移植物固定,石蜡包埋,行组织切片,做苏木精-伊红染色（HE染色）和CD31,CD144,VEGFR2,v WF的免疫组织化学染色,在病理显微镜下观察结果,分析体内血管生成的能力。8、取未诱导的干细胞作为对照组,诱导7天和14天的细胞作为实验组,提取蛋白和m RNA,使用实时荧光定量PCR检测分化诱导7天和14天时Notch1,Dll4和Hes1的表达,Western Blot电泳检测分化诱导7天和14天时Notch1,Dll4和Hes1蛋白的表达。9、在细胞诱导分化的过程中添加Notch通路特异性抑制剂FLI-06,探究Notch信号通路在骨髓来源间充质干细胞向血管内皮细胞分化过程中的调控作用。提取未诱导分化的细胞作为对照组,和细胞分化诱导7天和14天后的细胞,接种于Matrigel基质胶上重复体外Matrigel成血管实验,在倒置相差显微镜下观察成血管结果,用计算机软件计算和统计显微镜下血管长度,分析体外血管形成的能力。结果:1、4天左右可见成纤维细胞样聚集生长,第5-10天细胞生长较迅速,形成了较大集落,有的集落呈漩涡状排列,集落逐渐相互融合。传代后生长的速度加快,细胞形态相对单一,细胞的排列具有规则方向性,呈梭形。流式细胞仪鉴定细胞表面标志物显示,人骨髓间充质干细胞表达CD90、CD105和CD34,低表达CD14、CD31、CD45、CD144、VEGFR2、v WF,其中CD34,CD45属于造血干细胞标志物,表达程度较低,尚在可接受范围内。2、骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化7天后形态变化较明显,呈铺路石样外观,并有钙结节形成。经茜素红染色,将钙盐染成红色,并且在第7天已较为明显,在第14天时可见更大数量更多的钙结节,随着诱导时间增加,碱性磷酸酶活性随之增加。与未诱导分化的骨髓间充质干细胞相比,诱导7天和14天的碱性磷酸酶有较显著的增加,差异有统计学意义（p<0.01）。诱导后7d左右可见到细胞内有许多透亮密集的小脂滴形成,随着诱导时间的延长,细胞内脂滴逐渐增大。经验证,间充质干细胞分化能力较为理想,可作为诱导分化的种子细胞。3、细胞接种24小时后HUVEC贴壁,呈卵圆形、铺路石样形态,包浆丰富,椭圆核居中,边界清晰,流式细胞仪检测显示高表达CD105和CD144,高表达内皮细胞表面标志物CD31,中等表达VEGFR,v WF。低表达内皮祖细胞或造血干细胞表面标志物CD34,低表达CD14和CD45。4、共培养诱导7天和14 d后,人骨髓间充质干细胞在镜下的形态发生改变,失去细长的梭形和漩涡状的形状,接近铺路石样改变,流式细胞仪鉴定细胞免疫表型结果显示,除了CD31表达增加不明显外,CD144、VEGFR2和v WF的表达变化明显,其中CD144表达增加明显。5、通过细胞免疫荧光进一步分析细胞诱导分化后表面抗原表达,并通过荧光强度分析,诱导7d和14 d后血管内皮特异性抗原CD31和CD144表达明显高于对照组（P<0.05）,VEGFR2和v WF表达高于对照组（P<0.05）,该结果和流式结果具有一致性;荆豆凝集素UEA-1也在内皮细胞有表达,检测其表达同样高于对照组（P<0.05）。6、倒置显微镜下可见未诱导细胞散在或聚集分布,无网状结构形成,诱导7天的细胞可见少量条索形成,诱导14天条索结构增多,但与内皮细胞相比,仅有条索状结构生成,无结网现象。内皮细胞在Matrigel基质胶中仅在24小时即可迅速形成大量条索和多边形结构,彼此形成网络。7、未分化诱导的间充质干细胞在体内无法形成管状结构,细胞无规律杂乱散在分布。诱导分化7天的细胞在体内14天时间可形成规律的具有方向性的条索结构,并有形成管状结构的倾向。诱导分化14天的细胞镜下结构与诱导7天组相似,具有一定方向性,并有条索结构生成。疫组织化学结果显示,除了CD144在对照组中有少量表达,CD31、VEGFR2和v WF在对照组几乎不表达。CD144在诱导7天组和诱导14天组表达增加。CD31、VEGFR2和v WF在诱导7天组和诱导14天组开始表达并且显示随着诱导时间延长,表达有增加趋势。8、Western Blotting和q PCR结果显示诱导7天组与诱导14天组与对照组相比,Notch1表达升高,差异有统计学意义（p<0.05）。Dll4在诱导7天后的表达量与对照组相比稍有升高,当诱导分化14天后,Dll4表达有较明显的增高,差异有统计学意义（p0.05）。结论:热休克处理的人脐静脉内皮细胞可以诱导骨髓间充质干细胞在一定程度上向内皮细胞分化,诱导后的细胞具有一定血管形成能力和倾向。Notch信号通路调控骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化的过程,阻断Notch信号通路可以抑制间充质干细胞向内皮细胞分化,抑制其体外血管生成能力。