研究背景肺癌是全球恶性肿瘤死亡的主要原因之一。肺癌分为两种主要形式：非小细胞肺癌(NSCLC)阳小细胞肺癌,在所有肺癌中分别占到80%和20%。非小细胞肺癌(NSCLC)的发病率近年来仍在上升。非小细胞肺癌往往对化疗药物不敏感,因此进一步了解哪些分子能够促进肺癌生长,存活和转移是非常有意义的。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养素超家族一员,在神经系统病理生理学、神经病学和心理学的研究中,都显示出重要功能。最近,一些研究表明,脑源性神经营养因子及其受体TrkB可能参与一些恶性肿瘤的生长和转移,如神经母细胞瘤、胰腺导管癌、前列腺癌、肝细胞癌和肺癌等。然而目前在非小细胞肺癌中如何引起TrkB下游信号激活的分子机制尚不清楚。对于治疗和预防包括非小细胞肺癌在内的癌症来说,信号传感器和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族一直是重要的潜在靶标。信号传感器和转录激活因子3(STAT3)被认为通过JAK1或src-激酶来响应各种细胞因子和生长因子的调控。研究表明,在PC12细胞和老鼠的主盆神经节(MPG), STAT3参与介导Trk信号和功能。但STAT3是否作为BDNF/TrkB通路的下游分子在肺癌中起作用仍没有定论。在本研究中,我们发现,A549细胞中,STAT3信号的激活,促进BDNF产生,激活TrkB信号,进一步促进STAT3的活性,继而进一步促进BDNF的合成、释放以及TrkB及其下游信号的激活。研究目的1,探讨STAT3活性是否参与A549中TrkB的激活。2,探讨BDNF-TrkB信号是否影响STAT3活性及下游信号。实验方法1.细胞培养与处理人类的肺腺癌细胞系A549用Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)加入10%胎牛血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺,培养在37℃,饱和湿度,5%二氧化碳培养箱中。2.蛋白免疫印迹(WB)通过免疫印迹测定目的蛋白质的含量。简言之,等量的蛋白质(10μg/每个上样孔)被SDS-PAGE电泳分离并转移到0.22um PVDF膜上(Bio-Rad Inc.)。将膜孵育在封闭液中(0.2mM Tris,137mM Nacl,5%脱脂牛奶以及0.1%Tween-20)一个小时,然后放在4℃抗体中过夜。用TBST缓冲液(0.1% Tween-20, 0.2mM Tris,137mM NaCl)冲洗PVDF膜后,在室温下孵育HRP--结合的二抗(1：5000)一个小时,然后进行ECL化学发光检测。3.实时定量PCR反应脑源性神经营养因子的合成是通过定量RT-PCR来衡量的。细胞用PBS冲洗后,提取RNA。根据操作说明用TRNzol-A+RNA提取试剂(TIANGEN)提取总RNA。逆转录1μg的总RNA和RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Fermentas)。实时定量PCR使用SYBR GREEN (Roche)进行(MyiQ2 Bio-Rad)检测。用2-△△CT方法将每个孔的BDNFmRNA水平标准化。每个实验重复三次。4.统计分析显著性差异统计使用T检验和方差分析(方差分析)方法。数据显示用mean±SEM表示,p<0.05被认为是有显著变化的。所有的实验都重复三次。结果1.TrkB在人类肺癌细胞株A549中表达,并存在组成型激活为了检测TrkB的表达和激活,本实验用免疫印迹分析(WB)检测不同条件下A549细胞裂解液。分别用pan-TrkB抗体检测TrkB蛋白表达,用phospho-Trk抗体检测激活的TrkB。在肺癌细胞中加入BDNF刺激1h作为阳性对照。结果显示,TrkB在A549细胞中存在表达和组成型激活。在A549细胞中,只有145kD的TrkB-FL亚型的表达,没有TrkB.T1的表达。我们发现,在A549细胞无血清饥饿1h后TrkB磷酸化水平显著降低,而A549细胞无血清饥饿24小时后TrkB的磷酸化水平又恢复到饥饿前水平。在血清饥饿的条件下TrkB的磷酸化可以自发恢复,提示我们可能有配体BDNF自分泌机制的存在。为了确认这种可能性,我们检测在A549细胞中是否存在BDNF的表达。结果表明A549存在内源性BDNF的表达。这一发现证明了在A549细胞中BDNF作为主要因素激活TrkB。2.在A549细胞中STAT3转录因子是BDNF表达的主要影响分子为了研究在无血清的条件下STAT3是否激活,我们进行了免疫印迹分析法测定STAT3磷酸化水平。在A549细胞中,存在Stat3酪氨酸磷酸化以及丝氨酸磷酸化,1h的血清饥饿可以降低STAT3的磷酸化,但24h血清饥饿后,STAT3的磷酸化水平与对照组相比都升高。和Stat3酪氨酸磷酸化相一致的是,特异性的STAT3抑制剂——Sattic预处理A549,脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平都显著降低。在无血清条件下,Stat3活性被Sattic抑制能阻断A549细胞中BDNF在血清饥饿后的自发恢复。结果提示我们,在A549细胞中STAT3影响BDNF的表达。3.在A549细胞中BDNF是Stat3活性的一个重要的调节因子据先前的研究报道,STAT3同时是BDNF及其受体TrkB的下游信号目标。在A549细胞中,为了研究STAT3活性是否也受BDNF及其受体TrkB调节,在细胞水平,我们检测了存在Trk的抑制剂K252a时,STAT3的磷酸化水平。结果表明,阻断TrkB活性通路可以显著减少STAT3的磷酸化水平；而更多的脑源性神经营养因子可能进一步激活STAT3。为了检测在A549细胞中无血清条件下,STAT3活性的恢复是否依赖BDNF;我们在无血清条件下加入K252a后处理12 h；此时A549细胞被检测出STAT3的磷酸化水平低于没有加入K252a情况。结果表明,A549细胞在无血清条件下阻断TrkB活性可能放缓STAT3的自发恢复。这一发现强烈提示,在A549细胞中BDNF增强STAT3活性。4. STAT3诱导的BDNF表达参与Akt蛋白激酶的激活为了检验是否STAT3诱导BDNF表达与TrkB及其下游信号通路激活有关,我们检测了STAT3抑制剂是否影响AKT的活性。AKT是当细胞暴露于凋亡刺激下,重要的反应蛋白之一。我们分别加入K252a和Satic抑制剂处理细胞,然后我们检测Akt蛋白激酶的磷酸化水平。如图所示,再加入Sattic或K252a处理后,细胞中Akt磷酸化水平减少。结果表明,BDNF/TrkB和STAT3活性都与Akt蛋白激酶的激活相关。更重要的是,外源加入K252a不能进一步降低Sattic处理的细胞中Akt蛋白激酶的磷酸化水平。这些结果证明了STAT3诱导的BDNF表达参与Akt蛋白激酶的激活。讨论肺癌是目前全球恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一。在所有肺癌中,非小细胞肺癌(NSCLC)占到80%。而且NSCLC的发病率几年来仍在上升。非小细胞肺癌往往对现有化疗药物不敏感,因此进一步了解哪些分子参与了非小细胞肺癌的发生发展调控,具有重要的价值。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养素超家族一员,在神经系统的结构和功能研究中,都显示出重要功能。最近,一些研究表明,脑源性神经营养因子及其受体TrkB可能参与一些恶性肿瘤的生长和转移,如神经母细胞瘤、胰腺导管癌、前列腺癌、肝细胞癌和肺癌等。然而目前在非小细胞肺癌中如何引起TrkB下游信号激活的分子机制尚不清楚。本研究以非小细胞肺癌中常见的细胞模型——A549细胞为主要研究材料,研究了非小细胞肺癌中,BDNF激活及调控的机制。本研究主要有以下三个方面的发现：首先,本研究发现A549中TrkB的激活可以依赖其自分泌的BDNF实现,而不是依赖微环境中旁分泌的BDNF。而且表明这种BDNF的自分泌调控,依赖STAT3的活性。以往研究显示,在非小细胞肺癌中,存在TrkB表达的增加,以及外源加入BDNF可以增加TrkB的活性,及影响下游功能,但没有研究体内情况下,TrkB的激活所需的配体从何而来。本实验通过RT-PCR及WB实验,证明A549细胞中,存在BDNF的内源性表达,而且这种内源性表达的BDNF参与了’TrkB活性的调控。研究显示,A549细胞内,BDNF的调控受到STAT3的调控。STAT3在多种肿瘤调控中起到关键的作用,并且已经被报道参与了肺癌的发生发展。我们的研究显示,抑制STAT3的活性,可以显著减少BDNF的合成,提示STAT3是BDNF合成分泌重要的调控因子。第二,本研究发现BDNF/TrkB信号可以进一步上调STAT3的活性,而这种上调进一步增加了BDNF的表达及分泌,以及TrkB的激活。我们研究发现,不仅STAT3可以调控BDNF的合成,BDNF/TrkB活性可以反过来调控STAT3的活性。而这种BDNF引起的STAT3活性上调,进一步促进了BDNF的合成释放。这形成了一个典型的正反馈调控,可能是导致肺癌细胞中STAT3及TrkB活性大量增强的原因之一。第三,本研究发现这种STAT3依赖BDNF分泌的正反馈调控,影响了A549细胞中PI3K-AKT信号通路的激活。我们的结果显示,在A549中,阻断STAT3可以引起AKT磷酸化水平的下降,而这种下降不会因为Trk活性的抑制而更低。提示了STAT3对于AKT的活性调控,可能是由于对BDNF合成的调控所引起的。也就是说,STAT3依赖的BDNF分泌的正反馈调控,影响了A549细胞中PI3K-AKT信号通路的激活。研究意义：在本研究中,我们发现A549细胞中,BDNF以自分泌方式调控TrkB激活,并且存在正反馈回路：STAT3信号的激活,促进BDNF产生,激活TrkB信号,而TrkB的激活又进一步促进STAT3的活性,从而促进BDNF的合成、释放以及TrkB及其下游信号的激活。这种A549细胞自分泌BDNF反馈循环可能参与了A549生物功能调控。