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生物脱硫技术具有选择性高、反应条件温和、投资少、设备简单、运行费用低、对燃料热值影响小等优点,可能成为21世纪较廉价的降低石油产品硫含量的有效途径。然而,生物脱硫要走向工业化应用必须提高已有脱硫微生物的催化活性和稳定性,以降低其生产成本。目前,提高微生物脱硫活性的研究主要集中在提高细胞内脱硫酶的表达量和对二苯并噻吩及其衍生物(CxDBT)的代谢活性上。对于细胞摄取CxDBT的过程则缺少研究。本论文针对本实验室分离的专一性脱硫微生物Rhodococcuserythropolis L.SSE8-1,研究其摄取DBT过程对脱硫活性的影响,通过强化其摄取过程提高脱硫活性。
考察了R.erythropolis LSSE8-1摄取CxDBT效率对脱硫活性的影响,结果表明:脱硫酶对DBT、4,6-DMDBT没有选择性,CxDBT跨膜传递严重影响脱硫活性。LSSE8-1细胞裂解液上清在添加10 mM NADHNa2和20μM FMN时达到最大脱硫活性。在前3小时内,上清脱硫速率明显高于细胞裂解液和静息细胞。传质助剂Tween80可以显著提高LSSE8-1静息细胞脱硫活性。通过在LSSE8-1静息细胞及细胞裂解液中添加电子传递抑制剂NaN3,证实DBT跨膜传递过程为主动运输过程。
通过在CxDBT跨膜传递蛋白基因(HcuABC)保守区设计引物扩增其部分片段,证实其在Pseudomonas delafieldii R-8中存在。然后扩增了R-8的HcuABC全基因序列,对比研究发现其与P.aeruginosa NCIMB9571、LESB58、PA01、LJCBPP-PA14高度同源,显示了在进化关系上的相关性。其高度同源序列为ABC膜通道蛋白。
构建了DBT及其衍生物跨膜传递基因HcuABC表达载体pBSJ-HcuABC,并将其转入专一性脱硫菌R.erythropolis LSSE8—1中进行表达,脱硫活性明显提高。对于DBT脱硫率提高19％,对于4,6-DMDBT脱硫率提高13％。DBT及其衍生物跨膜传递过程对于微生物脱硫是一个重要甚至是一个限制性因素。因此,pBSJ-HcuABC表达载体对于构建高脱硫活性基因工程菌具有重要意义,必将在微生物脱硫工业化过程中起到重要作用。