瘦素(Leptin)是一种具有多种生理功能的神经免疫内分泌调节激素,由ob基因编码,由脂肪组织分泌进入血液,与一种短型受体结合后随血液循环跨过血脑屏障进入下丘脑,与特异性的瘦素受体(LPR)结合,通过激活某些特定的信号传递途径来抑制进食、增加能量消耗,此外还可通过与外周组织的瘦素受体(LPR)结合影响脂肪的分解合成和胰岛素抵抗等一系列机体代谢过程。因此,LPR对进一步发挥Leptin的生理功能起重要作用。Tartaglia LA于1995年运用表达克隆法首次从小鼠脉络丛cDNA表达文库中克隆出LPR,随后在鸟类和两栖动物中均已发现LPR。在硬骨鱼类中,最早由Wong等在海洋青鳉中克隆了Leptin长型受体的cDNA序列。随后,人们分别在河豚、日本青鳉、斑马鱼、大西洋鲑鱼、石斑鱼和黄颡鱼中克隆了Leptin长型受体的完整编码区,并从基因组定位、组织分布和发育表达调控等角度进行了初步研究。总体而言,目前关于鱼类瘦素受体的研究还很少。首先提取鲫鱼组织总RNA,通过RT-PCR获得Leptin基因,然后克隆到表达载体pGEX-4T-2中,在37℃、1mM IPTG条件下诱导表达,经检测大肠杆菌BL21(DE3)原核表达所得重组融合蛋白GST-Leptin以包涵体形式存在,表达量及可溶性几乎不受IPTG浓度变化的影响,但对温度的变化很敏感,随温度降低,表达量也大大减少。用8M尿素对包涵体进行变性处理,同时采用稀释复性和缓慢透析的方法使融合蛋白溶解,溶解的融合蛋白不能与GST Resin结合,可能是其没有完全恢复天然状态的构象。为此选择了标签较小的表达载体pET32a(+),经诱导发现在温度为25℃,IPTG浓度为0.1mM时,重组融合蛋白Trx-Leptin可溶性表达,可以用于Pull-down检测鲫鱼血清中的可溶性瘦素受体(sLR)。为了检测鲫鱼中的瘦素受体,根据鲫鱼Leptin长型受体胞外区第203-216和第632-645氨基酸序列,合成2条多肽,定期免疫动物,抽取血液,获得了相应的多克隆抗体,纯化后运用ELISA法检测抗体滴度,经检测抗体符合要求,分别用Anti-LPR203-216和Anti-LPR632-645检测鲫鱼不同组织中瘦素受体的表达水平,其中Anti-LPR203-216几乎检测不到信号,可能是该抗体不适用于Western Blot检测；Anti-LPR632-645检测结果表明鲫鱼肝脏中瘦素受体表达量明显高于鳃和肌肉,且在肝脏中检测到了瘦素受体的两种亚型,分子量分别约为110kD和90kD。通过RT-PCR获得了鲫鱼Leptin短型受体一种亚型的cDNA序列,与长型受体转录本相比,该短型受体转录本由于两个内含子未被剪切,导致其阅读框在跨膜区之前提前终止,可能编码Leptin可溶性受体蛋白(sLR)。Pull-down检测发现鲫鱼血清中存在该短型受体,分子量大约为115kD,比预期分子量大,推测sLR以糖蛋白的形式存在。多肽竞争性分析显示,用多肽孵育后抗体检测到的信号条带明显被抑制,证明抗体与目标蛋白的结合具有特异性。我们推测鱼类与人类和啮齿类动物不同,可能存在一种可溶性瘦素受体形成的新机制——“内含子滞留”,即在编码瘦素受体跨膜区的外显子上游有两个内含子滞留,提前引入一个终止密码子,使阅读框在到达跨膜区前被提前终止,编码Leptin的可溶性受体,并能够分泌到胞外,作为Leptin结合蛋白与Leptin结合。目前在鲤形目鱼类中尚没有关于可溶性Leptin受体的报道,本研究对鲫鱼Leptin可溶性受体的鉴定填补了鱼类Leptin受体研究在这方面的空白,也可为鱼类生产养殖活动中,更好地改善鱼类生长性能,提高鱼类品质,促进繁殖机能和调整鱼类摄食行为等提供理论依据。