丁香假单胞菌番茄变种DC3000 HrpA蛋白单链抗体的制备与分析

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Hrp(hypersensitive response and pathogenicity,Hrp)基因广泛存在于植物病原细菌中,参与Hrp极毛系统的组装,不仅可运输效应蛋白至植物细胞,导致HR或抗病性,还可运输致病性和毒性蛋白或抑制子活性物质,引起植物病害。hrp基因多串联成簇且相当保守,在诱导培养基或植物体内,基因簇中的hrpA基因编码细菌表面附属物Hrp极毛的结构蛋白HrpA。Hrp极毛在植物-病原细菌互作中扮演十分重要的角色。病原细菌能否使亲和性植物发病与其是否有Hrp极毛有直接的关系。 在对hrp基因进行深入研究的基础上,我们尝试设计新的化学药剂和抗体阻止Hrp Ⅲ型分泌系统的组装或致病毒力蛋白因子的分泌运输,从而有效限制植物细菌病害的发展。本研究从特异性的以转化了丁香假单胞菌番茄变种菌株DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)hrpA基因的大肠杆菌(SGpQEHrpA/Ps)BL21(DE3)表达的工程蛋白HrpA/Ps为抗原制备而得的单克隆杂交瘤细胞系中提取RNA,经过RT-PCR获得抗体可变区基因,利用一柔性肽段(Linker)连接形成单链抗体(single chain variable fragment,scFv),后应用基因工程方法,将scFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E连接,转化大肠杆菌TG1,获得单链抗体噬菌体文库。此后,利用噬菌体展示技术对抗体库进行了5轮淘选(panning),获得了HrpA特异性的单链抗体。 以单克隆抗体为来源的单链抗体,亲和力和特异性都较好,可以为进一步进行植物抗病基因工程和植物抗体研究提供基因来源。
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