癫痫是神经系统的慢性疾病之一,是由多种原因引起的一种慢性脑功能障碍性疾病。世界卫生组织(http://www.who.int)数据显示,癫痫影响全世界大约1～2%的人口,可见癫痫在世界范围内也是一个主要公共卫生问题。尽管大多数患者的预后良好,但仍有30%的患者应用适当抗癫痫药物(Anti-EpilepsyDrugs,AEDs)仍不能缓解,反复发作,迁延难愈,进展成为难治性癫痫(Drug Resistant Epilepsy,DRE)。因为癫痫给患者带来了严重的心理及生理的影响和沉重的负担,如何更好地控制癫痫的发作一直是癫痫专科医生研究的重点。柴贝止痫汤是临床治疗癫痫的经验用方,长期实践证实具有良好的疗效。在前期的实验研究中表明柴贝止痫汤具有降低耐药蛋白的表达的作用,但其具体机制尚待深入研究。围绕上述问题,本研究进行三方面的探讨,包括临床试验,离体实验及在体实验。[目的]通过采用随机对照试验的方法研究添加柴贝止痫颗粒治疗DRE,观察柴贝止痫颗粒的有效性及安全性;运用离体实验,观察柴贝止痫颗粒对大鼠脑微血管内皮细胞(Rat Brain Microvascular Endothelial Cells,RBMEC)中 P 糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的作用并研究其具体机制与孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)的相关关系;通过在体实验观察柴贝止痫汤对海人酸(KainicAcid,KA)致痫大鼠模型脑组织中PXR及P-gp的作用,使在体实验与离体实验相互验证,达到探究柴贝止痫颗粒的疗效作用机制的目的。[方法]临床试验:采用随机对照研究的方法,根据纳入标准共纳入癫痫患者60例,随机分为治疗组和对照组。在保持原有AEDs不变的情况下,治疗组添加柴贝止痫颗粒治疗,对照组添加柴贝止痫颗粒安慰剂治疗,治疗周期3个月。主要疗效指标包括治疗后每个月的月发作频次、观察期内无发作率(SeizureFree)、50%应答率(50%Response Rate,50%RR),次要疗效指标包括中医证候学评分、癫痫伴随症状评分及脑电图治疗后的有效率评价;癫痫患者生活质量采用癫痫患者生活质量量表-89题(Quality of Life in Epilepsy Inventory-89,QOLIE-89)分别进行总分及17个单项的分值评价;患者的抑郁情绪采用癫痫患者抑郁量表(Neurological Disorders Depression Inventory for Epilepsy,NDDI-E)、抑郁自评量表(Self-rating Depression Scale,SDS)、汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)进行评价;患者的焦虑情绪采用汉密尔顿焦虑量表(Hamilton Anxiety Scale,HAMA)进行评价;安全性评价包括入组前后的血常规及肝肾功能检查。观察过程中不良事件随时记录。基础实验:分为离体和在体实验。离体实验通过培养RBMEC,利用CCK-8检测利福平、酮康唑、柴贝止痫颗粒对RBMEC活力的影响,从而选择后续药物实验浓度;通过RT-PCR检测各个浓度的利福平对NR1|2 mRNA的作用选择合适的利福平干预浓度;制备利福平干预后PXR高表达的细胞模型,酮康唑作为抑制剂模型,经中药柴贝止痫汤颗粒干预后,通过WesternBlot、RT-PCR观察PXR、P-gp的表达情况。在体实验采用侧脑室注射KA制备癫痫大鼠模型,分为正常组(N)、模型组(M)、卡马西平组(CBZ)、柴贝止痫汤组(CBZXD)和柴贝止痫汤+卡马西平组(CBZ+CBZXD)共计5组,给药3个月后分别灌注脑组织及取新鲜大鼠海马组织,通过免疫组化、RT-PCR、Western Blot方法观察各组大鼠海马组织中PXR、P-gp的基因及蛋白的表达情况。[结果]临床试验:(1)临床研究共纳入60例患者,入组时治疗组和对照组在年龄、教育水平、婚姻状况、病程、首次发病年龄、癫痫相关既往史、顺产与否、家族史、过敏史等方面比较,P>0.05,差异均无统计学意义;两组间性别比较,P<0.05,差异具有统计学意义。入组前一个月的发作频次两组比较,P>0.05,差异无统计学意义,两组基线基本一致,具有可比性。(2)主要疗效指标:治疗第2、3个月两组的发作频次与治疗前1个月发作频次降低,P<0.05,差异具有统计学意义,且两组下降趋势在直线拟合模型上不平行,P<0.05,差异具有统计学意义。无发作率的比较,治疗第3个月治疗组的无发作率为35.71%,明显优于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义。50%RR比较,治疗2个月、3个月后治疗组的50%RR分别为57.14%及82.14%,较对照组升高,P<0.05,差异具有统计学意义。(3)次要疗效指标:中医证候学评分、癫痫伴随症状量表、脑电图的有效率在治疗3个月后治疗组较对照组升高,P>0.05,差异无统计学意义。(4)生活质量量表评价:QOLIE-89两组比较,治疗3个月后治疗组较对照组总分升高,P>0.05,差异无统计学意义,而生活质量量表中在精力/疲劳、发作恐惧、药物副作用3项分值治疗组较对照组升高,P<0.05,差异具有统计学意义。(5)患者抑郁焦虑情况评价:NDDI-E、HAMD治疗3个月后两组比较,差异无统计学意义;SDS治疗后治疗组较对照组分值降低,P<0.05,差异具有统计学意义。HAMA在治疗后3个月治疗组分值较对照组降低,P>0.05,差异无统计学意义。基础实验:(1)经CCK-8法检测酮康唑、柴贝止痫颗粒对RBMEC的活力影响,分别选用酮康唑5μg/ml、柴贝止痫颗粒100μg/ml用于后续实验,结合利福平对RBMEC活力的影响及其对NR1|2 mRNA扩增的影响,选用利福平5μg/ml用于后续实验;(2)由利福平(Sμg/ml)诱导PXR高表达模型,经中药柴贝止痫颗粒(100μg/ml)干预后,通过RT-PCR及WesrternBlot检测到RBMEC上PXR、P-gp的表达降低,P<0.05,差异具有统计学意义。(3)免疫组织化学结果表明大鼠海马组织模型组、卡马西平组P-gp的表达较正常组表达升高,但差异无统计学意义,而柴贝止痫汤组P-gp表达降低,P<0.05,差异具有统计学意义。(4)RT-PCR及Western Blot检测结果显示KA大鼠海马组织中模型组及卡马西平组PXR、P-gp的表达升高,P<0.05,差异具有统计学意义;柴贝止痫汤组、卡马西平+柴贝止痫汤组的PXR表达较模型组降低,P<0.05,差异无统计学意义;柴贝止痫汤组、卡马西平+柴贝止痫汤组海马组织中P-gp的表达降低,P<0.05,差异具有统计学意义。[结论](1)添加柴贝止痫颗粒治疗难治性癫痫复杂部分性发作有效、安全,在改善患者生活质量方面,对精力/疲劳、发作恐惧、药物副作用三项具有一定的作用,同时能够改善患者自身抑郁情绪。(2)柴贝止痫颗粒可以抑制因利福平所造成的PXR及P-gp的高表达;柴贝止痫汤可以下调因癫痫反复发作和应用卡马西平所诱导的PXR及P-gp的高表达。其调节P-gp的机制可能与下调PXR的表达相关,从而调节BBB的通透性,提高AEDs在脑组织中的浓度,抑制癫痫耐药。