【研究目的】原发性高血压是目前不能明确发病原因的高血压,其发病比例超过高血压总量的95%以上,而且其多种并发症如脑卒中、心力衰竭、高血压性肾损害和眼底病变等长期威胁着人类的健康,是目前心血管领域的研究热点之一。大量研究显示交感神经系统兴奋性的增加与高血压的形成、发展和预后密切相关。交感神经系统的调控中枢位于脑干的头端延髓腹外侧区(RVLM),它是维持正常动脉血压和交感神经系统兴奋性的关键部位。近年来研究表明,RVLM氧化应激是高血压交感输出亢进的重要病理机制之一,但RVLM氧化应激的来源和诱发机制尚不明确。研究发现,一氧化氮合酶(NOS)脱偶联是引发氧化应激增强的一个重要原因。NOS脱偶联是指具有正常生物学功能的NOS二聚体解聚成单体的现象,而四氢生物蝶呤(BH4)是维持NOS二聚体及其功能必不可少的辅因子。脱偶联的NOS不能催化一氧化氮(NO)的产生,但仍能够传递来自还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活化产生的电子,使O2形成超氧阴离子(?O2-),增强氧化应激的水平。因此,我们的主要研究目标是明确NOS脱偶联是否参与了高血压病理状态下RVLM的氧化应激及其在高血压心血管功能调节中的作用和意义,并探索如何改善高血压交感中枢NOS脱偶联。血管紧张素1-7(Ang1-7)是肾素-血管紧张素系统(RAS)中的成员之一,由血管紧张素转化酶2(ACE2)催化、内切酶和羧肽酶酶切血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)羧基端的苯丙氨酸后形成,在外周循环系统中,通过作用于其特异性Mas受体产生与AngⅡ相互制衡的心血管保护效应,对心血管活动稳态的维持发挥着极其重要的作用。研究表明,在中枢神经系统中的Ang1-7对心血管活动也具有重要的调控作用,但能否通过改善RVLM内NOS脱偶联降低氧化应激从而发挥心血管保护效应并不清楚。我们前期研究发现,在WKY大鼠RVLM急性灌注AngⅡ能够抑制1型三磷酸鸟苷酸(GTP)环化水解酶(GTPCH1)的表达,从而引起神经元型NOS(n NOS)脱偶联,GTPCH1是BH4合成的限速酶。因此提出本实验的假设,即在自发高血压大鼠(SHR)RVLM中Ang1-7能够通过促进GTPCH1的表达从而改善n NOS脱偶联,进而减少氧化应激降低血压。在本实验中我们通过以下几方面开展研究工作:第一,我们直接检测SHR和正常血压的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠RVLM内NOS二聚体/单体的比值、GTPCH1的表达水平和BH4的含量,初步探索SHR RVLM内是否存在NOS脱偶联增加的现象;第二,我们通过RVLM腺病毒过表达GTPCH1进一步探索上调BH4含量,明确增加BH4的含量是否可以改善SHR RVLM内的NOS脱偶联和氧化应激,进而降低交感神经兴奋性和血压;第三,我们通过RVLM慢病毒过表达ACE2探索上调Ang1-7的含量是否能够改善NOS脱偶联,进而降低氧化应激、交感神经兴奋性和血压;最后,我们以CATH.a神经元为模型,在细胞水平探索了环磷酸腺苷(c AMP)是否参与了ACE2/Ang1-7/Mas轴改善NOS脱偶联的过程。【研究方法】本实验使用的动物模型为SHR和WKY大鼠,细胞模型为CATH.a神经元。通过无线遥感监测SHR和WKY大鼠RVLM过表达GTPCH1前后的血压(BP)和心率(HR)变化,记录时间为转染前7天至转染后第15天;记录SHR和WKY大鼠的RVLM内过表达ACE2前后清醒状态下的平均动脉压(MAP)和HR,记录时间为转染前1周至转染后6周,并监测心血管功能及肾交感神经的放电活动(RSNA);利用高效液相(HPLC)色谱法检测RVLM组织中BH4含量;利用HPLC电化学法检测24-h尿液中去甲肾上腺素(NE)的含量;利用低温western blot检测NOS二聚体的表达水平;利用常规western blot检测NOS、磷酸化NOS、GTPCH1和ACE2的表达水平;利用超氧阴离子荧光探针(DHE)检测?O2-的含量;利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测RVLM组织及CATH.a细胞中的AngⅡ、Ang1-7和c AMP的含量。【结果】1 SHR RVLM内n NOS脱偶联现象增加发现SHR的RVLM内BH4的含量(0.088±0.032 vs 0.279±0.056μg/g)、n NOS二聚体/单体的比例(1.00±0.23 vs 0.06±0.16)、p-n NOS/T-n NOS的比例(1.00±0.09 vs0.63±0.08)和GTPCH1的表达水平(1.00±0.05 vs 0.7±0.04)均较WKY组明显减少(P<0.05)。2 RVLM过表达GTPCH1对心血管活动的影响此部分实验分为4组:WKY-GFP、WKY-GTPCH1、SHR-GFP和SHR-GTPCH1组。2.1 SHR RVLM过表达GTPCH1降低血压和交感神经兴奋性SHR和WKY大鼠RVLM过表达GTPCH1前1周记录MAP分别为102±4 mm Hg和146±5 mm Hg,HR分别为300±23 bpm和290±25 bpm;过表达GTPCH1后第9天SHR-GTPCH1组的MAP与SHR-GFP组比较平均降低15 mm Hg(P<0.05),HR没有统计学差异。通过HPLC测得SHR-GTPCH1组24-h尿中NE含量较SHR-GFP组(1.3±0.05 vs 1.0±0.04μg)显著减少(P<0.05)。2.2 SHR RVLM过表达GTPCH1改善n NOS脱偶联和氧化应激SHR-GTPCH1组n NOS二聚体/单体的比例较SHR-GFP组(1.69±0.12 vs0.49±0.05)显著增加(P<0.05);SHR-GTPCH1组?O2-的含量较SHR-GFP组(1.6±0.08vs 2.3±0.09 A.U.)显著降低(P<0.05)。3 RVLM过表达ACE2对心血管活动的影响此部分实验分为4组:WKY-GFP、WKY-ACE2、SHR-GFP和SHR-ACE2组。3.1 SHR RVLM过表达ACE2降低血压和交感神经兴奋性与对照SHR-GFP相比,SHR RVLM过表达ACE2 6周后MAP(151±8 vs 170±13mm Hg)、HR(365±27 vs 389±32 bpm)和肾交感神经放电活动(RSNA)(25±2 vs 40±3%)明显降低(P<0.05)。3.2 SHR RVLM过表达ACE2改善NOS脱偶联与SHR-GFP组相比,SHR RVLM过表达ACE2后Ang1-7/AngⅡ的比值(0.40±0.009 vs 0.22±0.02)、n NOS二聚体/单体的比值(6.3±1.6 vs 3.3±0.4)和GTPCH1的表达水平(0.24±0.08 vs 0.08±0.01)显著增高(P<0.05)。3.3 SHR RVLM过表达ACE2上调c AMP的含量与SHR-GFP组相比,SHR RVLM过表达ACE2后c AMP的含量(16.7±1.7 vs12.9±1.8 pmol/mg)显著增高(P<0.05)。4 Ang1-7可以通过上调细胞内c AMP含量改善NOS脱偶联4.1 Ang1-7上调CATH.a细胞c AMP的含量和GTPCH1的表达此部分实验分为4组:Control、DMSO、c AMP激动剂(Forskolin)和Ang1-7组。Ang1-7处理组c AMP的含量(4.8±0.83 vs 2.19±0.98 pmol/mg)和GTPCH1的表达水平(2.38±0.05 vs 1.0±0.04)均明显高于Control组(P<0.05)。4.2 c AMP抑制剂(Bupivacaine-HCl)可以抑制Ang1-7的作用此部分实验分4组:Control、DMSO、Bupivacaine-HCl和Bupivacaine-HCl+Ang1-7组。与Control组相比较,Bupivacaine-HCl组c AMP的含量(0.55±0.14 vs 2.5±0.48pmol/mg)和GTPCH1的表达水平(0.46±0.02 vs 1.1±0.006)显著降低(P<0.05);Bupivacaine-HCl+Ang1-7组c AMP的含量(0.75±0.34 vs 2.5±0.48 pmol/mg)和GTPCH1的表达水平(0.55±0.14 vs 1.1±0.006)明显低于Control组(P<0.05)。【结论】本实验研究表明SHR RVLM内NOS脱偶联诱导的氧化应激参与高血压心血管功能紊乱机制。ACE2/Ang1-7/Mas轴能够通过上调c AMP的含量促进GTPCH1的表达,进而改善高血压中枢NOS脱偶联抑制氧化应激。