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背景及目的：RNAi技术在抗HIV-1研究方面表现出一定的优势和应用潜力。针对HIV-1病毒的高突变性，本实验室在前期研究中，以ccr5、pol和vif基因为靶点构建了稳转细胞株293T-CCR5、293T-POL和293T-VIF；针对3个靶基因各自设计和构建了4个miRNA表达载体，从中各筛选出一个沉默效果最好的，记为pccr5-1-4，ppol-3-4和pvif-2-1。在此基础上，本研究将3个miRNA串联到一个表达载体上，并利用Gatewan重组技术构建成慢病毒表达载体pLenti6.3-ccr5-pol-vif，理论上，该重组载体可同时作用于三个靶基因。将其转染进293T-CCR5细胞，293T-POL细胞和293T-VIF细胞，进行功能分析，为进一步开展抗HIV-1研究提供基础。方法：pcDNA6.2-GW/EmGFP载体上含有酶切位点BamH I，Xho I和Bgl II，且BamH I与Bgl II是同尾酶，利用这一特性将载体中目的片段miR-ccr5，miR-pol和miR-vif串联起来，获得pcDNA6.2-GW/EmGFP-ccr5-pol-vif；Eag I单酶切载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-ccr5-pol-vif后，利用Gatewan重组技术构建成慢病毒表达载体pLenti6.3-ccr5-pol-vif，重组载体经测序验证其正确性；通过qRT-PCR技术检测其对靶基因的抑制效率和对IFN-β表达的影响；Western Blot法检测其对CCR5、POL和VIF蛋白表达的影响；采用MTT法检测其对被转染细胞有无毒性伤害。结果：测序结果表明重组载体构建成功；qRT-PCR结果显示pLenti6.3-ccr5-pol-vif对ccr5、pol和vif基因都有一定抑制作用，抑制效率分别达到25%、35%和13%；Western Blot结果显示转染了pLenti6.3-ccr5-pol-vif的293T-CCR5、293T-POL和293T-VIF细胞中，靶蛋白表达水平与空白对照组相比分别降低18%、55%和65%(P<0.01)；转染细胞中IFN-β的表达未明显增加； MTT实验证实转染pLenti6.3-ccr5-pol-vif不会对细胞的存活率造成影响。结论：1.成功构建了慢病毒表达载体pLenti6.3-ccr5-pol-vif；2. pLenti6.3-ccr5-pol-vif可同时靶向ccr5、pol和vif三个基因发挥抑制作用；3. pLenti6.3-ccr5-pol-vif不会引发转染细胞中的干扰素效应，也不会产生细胞毒性，为进一步开展抗HIV-1研究提供实验基础。