研究背景结直肠癌是人类常见消化道恶性肿瘤。发病率和死亡率均位列肿瘤谱前列。而结直肠癌治疗失败的原因主要是由于术后的局部浸润和转移复发,而在远处转移事件中,肝脏是最主要的转移部位。结直肠癌的发生、发展是一个受多基因、多步骤调控的复杂过程。越来越多的基因被发现与结直肠癌的发病或者转移相关。本课题组前期通过对一个患者的肠道正常组织、腺瘤和腺癌组织进行全外显子高通量深度测序,发现在腺瘤样本中存在CDH20基因突变,且腺瘤和腺癌样本的CDH20表达降低。既往也有报道发现CDH20基因在乳腺癌和食管癌中的突变或缺失。提示在结直肠癌的发展过程中,CDH20基因具有相关未知的作用。CDH20是以E-钙粘蛋白为代表的钙粘蛋白超家族中的一员,已有大量的研究证明,钙粘蛋白超家族是一个与肿瘤密切相关的蛋白家族,而E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白也是细胞上皮间质转化(EMT)过程中的关键蛋白,参与了肿瘤细胞的侵袭和转移。目前CDH20与肿瘤的关系还不明确,在结直肠癌中的研究尚未见报道。结合前期实验结果,该基因可能参与了结直肠癌发生或发展的过程,而其具体功能尚未阐明。本课题对其进行更加全面的研究,以期更加深入的了解CDH20在结直肠癌中发挥的作用,从机制明确其潜在的临床意义,以及CDH20在干预阻断转移中具有的潜在作用,提供判断转移、预测预后的潜在分子标志。实验方法Ⅰ CDH20与结直肠癌临床病理特征的相关性分析收集临床结直肠癌癌和癌旁组织标本53例,提取标本组织总RNA,利用RT-qPCR法检测标本中CDH20的相对表达并与临床病理特征进行相关性分析。ⅡCDH20基因功能的体内外实验研究体外实验1、使用RT-qPCR和Western Blot来评价不同结直肠癌细胞系中CDH20的表达,包括SW620、SW480、LoVo、RKO、HCT116、HT29、CT26, SW1116细胞系。2、构建慢病毒CDH20高表达和CDH20敲除的稳定转染的结直肠癌SW1116-CDH20、SW1116-shCDH20细胞系及对照细胞系。3、.体外实验通过免疫荧光观察CDH20蛋白在细胞中的位置,MTT增殖实验、细胞克隆实验、细胞粘附实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验来研究CDH20在增殖和迁移侵袭中的作用。体内实验4、体内实验通过向裸鼠脾脏包膜内注射高表达CDH20细胞及对照细胞系后切脾进行肝转移实验。机制研究5、通过RT-qPCR和Western Blot来检测CDH20高表达及敲除后细胞系的EMT相关蛋白表达情况,以研究CDH20对EMT过程的影响。6、通过免疫荧光、免疫共沉淀和Western Blot以说明β-连环蛋白(β-catenin)在细胞内的定位及和CDH20的相关性。实验结果I CDH20与结直肠癌临床病理特征的相关性分析CDH20在结直肠癌淋巴结阳性和肝转移患者癌组织中表达明显低于淋巴结阴性及无肝转移患者,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、浸润深度无明显相关性。提示CDH20在结直肠癌的侵袭、转移中发挥抑制作用；II CDH20基因功能的体内外实验研究体外实验：1、CDH20定位于细胞膜,通过慢病毒所介导CDH20高表达对肿瘤细胞形态及增殖能力无明显影响。2、CDH20可增加肿瘤细胞与纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)的粘附能力,并显著降低肿瘤细胞体外迁移和侵袭能力。体内实验：3、裸鼠实验证实CDH20高表达可以抑制肿瘤细胞的肝脏转移能力。机制研究：4、上皮标志物E-钙粘蛋白和β-连环蛋白在CDH20高表达时表达升高,而间质标志物波形蛋白和N-钙粘蛋白表达则明显降低,提示CDH20能抑制甚至逆转肿瘤细胞的EMT过程。5、β-catenin增高后未在核内聚积,可能直接与细胞膜上的CDH20结合。结论1、CDH20在结直肠癌淋巴结阳性和肝转移患者癌组织中低表达,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、浸润深度无明显相关性。2、CDH20高表达未改变SW1116细胞体外基质胶培养上培养形态,对细胞体外增殖能力无明显影响；3、CDH20主要表达于细胞膜,能增强肿瘤细胞系SW1116与纤维连接蛋白(FN)之间的粘附能力；4、CDH20能够增强E-钙粘蛋白和p-连环蛋白的表达,同时抑制N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达,抑制大肠癌细胞的体外迁移、侵袭能力,抑制EMT过程；CDH20高表达后能显著降低体内肿瘤细胞肝脏转移的能力。