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研究背景在肿瘤的治疗方法中,化疗占据着不可替代的地位。自从化疗药物应用于临床以来,虽对少数恶性肿瘤的治疗取得了成功,但在大多数恶性肿瘤中收效却不大,这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。而肿瘤耐药的主要原因是肿瘤细胞耐药基因的过度表达,产生相关蛋白质,如:肺耐药蛋白(lung resistance protein、LRP)、多药耐药蛋白(multidrug resistance-associated protein、MRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。这三种耐药蛋白分别是LRP基因、MRP基因和MDR1(multidrug resistancel gene)基因的表达产物。其中MDR1/P-gp介导的肿瘤多药耐药(MDR ,multidrug resistance)是目前研究最广泛深入的机制。MDR1基因编码的P-gp是导致MDR最直接的原因,因此MDR1/p-gp的检测在肿瘤化疗的病人极其重要。目前MDR1和p-gp的检测方法主要有两类,一类是蛋白质测定法,一类是mRNA测定法。但是这些检测方法首先都必需依赖于肿瘤组织的采样,给病人带来巨大痛苦,而且还受MDR1在细胞表达的量以及检测方法的敏感性等多因素的影响。如何从分子水平实现无创评价实体肿瘤组织多药耐药性,对于临床肿瘤多药耐药监测将是一个重大突破。氧化铁磁性纳米颗粒具有超顺磁性、颗粒为纳米级、可以作为生物大分子(如基因、多肽等)载体等特性。MDR1反义脱氧寡聚核苷酸是指与MDR1基因碱基互补,并能与之结合的一段DNA片段。以氧化铁磁性纳米颗粒为基因载体将MDR1反义脱氧寡聚核苷酸导入体细胞内,应用磁共振技术探测体细胞内的磁信号达到评价实体肿瘤组织MDR1表达情况的目的。为从分子水平实现无创评价实体肿瘤组织多药耐药性提供了可能。本实验前期研究表明氧化铁磁性纳米颗粒纯度较高、粒径大小一致、细胞标记率高。我们分别以人结肠癌细胞(LS174T、耐长春新碱HCT-8/VCR)细胞株进行实验,利用合成的氧化铁磁性纳米颗粒,构建MDR1反义寡聚核苷酸载体,并进行体外试验,对氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体转染开展研究。目的合成、鉴定氧化铁磁性纳米颗粒MDR1反义寡载体聚核苷酸复合物,并进行体外细胞转染试验,评价氧化铁磁性纳米颗粒做为基因载体的可行性。方法1.PAGE评价DCIONP颗粒MDR1asODN复合物,以及此复合物在不同条件下的稳定性。2.流式细胞术测定LS174T、耐长春新碱HCT-8/VCR细胞内P-gp表达水平。3.MRI测定标记细胞磁信号变化。4.细胞转染的检测:铁染色法观察LS174T、耐长春新碱HCT-8/VCR细胞内染成蓝色的铁颗粒、荧光显微镜观察细胞内的荧光信号、透射电镜观察细胞内的铁颗粒。结果1.PAGE显示DCIONP与MDR1asODN在不同的pH值均有良好的结合能力;pH7.4的弱碱性条件下,PLL-CIONP与MDR1 asODN在一定质量比有良好的结合能力;PLL-CIONP-asODN在人血清、自来水等条件下37℃孵育表现稳定。2.流式细胞术测定结果提示:LS174T组细胞内罗丹明荧光显著高于HCT-8/VCR组,提示HCT-8/VCR细胞中P-gp高表达。3.MRI测定标记细胞磁信号表明:随着细胞数的增加标记细胞的T2磁信号值逐渐减弱趋势。4.细胞转染:铁染色LS174T细胞内蓝色颗粒则较HCT-8/VCR细胞少;荧光显微镜观察LS174T细胞内FAM荧光强度低于HCT-8/VCR细胞。结论氧化铁磁性纳米颗粒与MDR1反义寡聚核苷酸复合物性质稳定,其可以作为基因载体转染MDR1反义寡聚核苷酸。氧化铁磁性纳米颗粒具备医用1.5T磁共振仪可探测信号。