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目的类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以慢性,进行性,侵袭性外周关节炎为主要表现的系统性自身免疫病。RA的病因及其发病机制仍是不完全清楚的。RA的主要病理特征为持续性关节滑膜炎和侵袭性血管翳形成,随着病情的进展,出现骨和软骨的破坏,最终导致畸形甚至引起残疾。血管新生是侵袭性血管翳形成的基础。中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞在适当的刺激下,形成并释放的由颗粒蛋白,抗菌肽等蛋白修饰的染色质构成的纤维网状结构,在多种疾病的发生发展中发挥了重要作用。已有研究报道NETs是RA患者的瓜氨酸化抗原的重要来源之一,推测NETs参与RA的发生发展。在慢性阻塞性肺疾病中,NETs可促进肺部血管新生。血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种急性时相反应蛋白,本课题组前期研究发现SAA可以诱导NETs形成。本研究在以往的工作基础上,进一步探讨了NETs在RA血管新生中的作用及SAA诱导NETs形成的分子机制。方法1.利用组织免疫荧光染色观察RA,OA滑膜组织中NETs存在情况。2.利用密度梯度离心提取健康体检者的外周血中性粒细胞,用LPS刺激诱导NETs形成,并提取NETs,应用nanodrop分光光度计检测DNA-NETs浓度。3.利用MTT实验分析NETs对体外培养的HUVECs增殖的影响。4.利用细胞划痕试验分析NETs对HUVECs迁移的影响。5.构建体外血管形成的三维模型分析NETs对HUVECs管腔形成的影响。6.利用密度梯度离心法提取类风湿关节炎患者和健康体检者的外周血中性粒细胞,提取得到的中性粒细胞进行HE染色鉴定细胞纯度,DAPI染色观察细胞核形态。7.提取得到的中性粒细胞分为RA组(8例)和HC组(13例),做以下处理:对照组,LPS刺激组及SAA刺激组,分别加入Tris-HCL缓冲液,LPS和SAA,刺激4h,DAPI染色后在荧光显微镜下观察NETs形成。8.提取健康体检者的外周血中性粒细胞,分为对照组,SAA组,(SAA+anti-TLR4-Ab)组,LPS组,(LPS+anti-TLR4-Ab)组和anti-TLR4-Ab组,加入相应刺激剂处理4h后,收集上清用于后续实验。细胞爬片免疫荧光染色后于荧光显微镜下观察NETs形成。9.应用Pico Green试剂盒检测上清中DNA浓度。配制DNA标准液,绘制标准曲线,用于上清中DNA浓度计算。结果1.组织免疫荧光结果显示与OA患者滑膜组织相比,RA患者滑膜组织NETs形成较多。2.荧光染色法观察得到LPS可诱导NETs形成,且提取的DNA-NETs浓度为27.8mg/L/106细胞。3.MTT实验分析得到与对照组(0.405±0.445)相比,NETs刺激组(1.241±0.068)明显促进了内皮细胞增殖(p<0.05),在用DNaseⅠ处理NETs(0.919±0.056)后,NETs促进内皮细胞增殖的能力明显受到抑制(p<0.05)。4.划痕实验分析发现与对照组(16.57±1.066%)相比,NETs可以促进内皮细胞迁移(78.43±1.784%),在用DNaseⅠ处理NETs(44.57±1.798%)后,NETs促进HUVECs迁移的能力明显受到抑制(p<0.05)。5.体外血管形成的三维血管模型显示,NETs可以促进HUVECs节点的形成(2.857±0.3401 vs.1.143±0.4041,p<0.05),用DNaseⅠ处理NETs后,该能力受到抑制(1.571±0.3689 vs.2.857±0.3401,p<0.05)。6.HE染色显示中性粒细胞纯度达到95%以上,DAPI染色观察到了中性粒细胞典型的杆状核和分叶核形态,提取的中性粒细胞纯度及状态都达到实验要求。7.镜下计数结果显示无论是SAA刺激组(19.10±0.7922%vs.14.67±1.078%,p<0.05)或者是自发形成组(7.394±0.5270%vs.4.85±0.3659%,p<0.05),RA组中性粒细胞比HC组中性粒细胞相对更易形成NETs,并且镜下观察发现形成的NETs更典型。8.结果显示,SAA刺激组(14.58±1.058%)和LPS刺激组(13.70±0.794%)的形成NETs的百分率均明显高于对照组(5.734±0.428%,p<0.05),且在用中和抗体预处理后再行SAA刺激组(6.915±0.418%)的NETs形成百分率明显低于SAA刺激组(14.58±1.058%,p<0.05),(LPS+anti-TLR4 Ab)组(6.905±0.4646%)也明显低于LPS刺激组(13.71±0.7951%,p<0.05)。9.结果显示,SAA刺激组(36.89±1.288μg/m L)和LPS刺激组(35.23±0.7689μg/m L)细胞培养上清中的DNA浓度明显高于对照组(12.65±0.8157μg/m L,p<0.05)。在经TLR4中和抗体预处理后行SAA刺激组(16.34±0.611μg/m L)上清DNA浓度明显降低(p<0.05)。(LPS+anti-TLR4-Ab)组(15.77±0.8893μg/m L)也明显低于LPS刺激组(p<0.05)。结论1.RA患者的中性粒细胞更易形成NETs。与OA滑膜组织相比,RA滑膜组织中存在更多的NETs。RA患者中性粒细胞处于预激活状态,其形成NETs的能力比健康对照组更强。2.NETs可促进血管新生。NETs可明显促进HUVECs增殖,迁移和管腔形成,提示NETs可促进血管新生。当用DNaseⅠ分别预处理NETs后,NETs促进血管新生的作用受到抑制,提示NETs中DNA在血管新生中发挥了重要作用。3.SAA可以通过与TLR4相互作用诱导中性粒细胞形成NETs。