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目的:以β淀粉样肽(Aβ)作为诱导大鼠学习记忆损伤和体外神经细胞及线粒体损伤的神经毒，研究大豆异黄酮(SIF)单独或联合叶酸(FA)拮抗Aβ引起的损伤及其保护作用机制。从膳食因素预防的角度，为早期预防和控制学习记忆损伤相关疾病提供科学依据。
方法:
1.体内实验：
(1)神经毒性研究。健康Wistar大鼠(雄性、体重250±30g)按体重随机分为3组(15只/组)，分别于侧脑室注射生理盐水、Aβ1-40 10μg和Aβ25-35 20μg。于术后7d，Morris水迷宫试验检测大鼠学习记忆能力；术后14d，股动脉取血，检测大鼠血清中抗氧化相关指标，观察不同Ap片段的神经毒性。
(2)干预研究。实验分为5组(对照、Aβ模型、SIF、FA和SIF与FA联合(sIF+FA)干预组)，每组15只，分别经灌胃给服0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、0.5％CMC-Na、SIF(160mg/kg·bw·d)、FA(0.7mg/kg·bw·d)和SIF(160mg/kg·bw·d)+FA(0.7mg/kg·bw·d)，14d后，对照组于侧脑室注射生理盐水，Aβ模型、SIF、FA、SIF+FA干预组于侧脑室注射Aβ1-40 10μg，检测方法和指标同毒性实验。
2.体外实验：
(1)神经毒性研究24h龄Wistar大鼠大脑皮质神经细胞，经48h培养后，在培养基中分别加入Aβ25-35(终浓度为25μM)和Aβ31-35(终浓度为25μM)建立大鼠大脑皮质神经细胞损伤模型。染毒后继续培养24h，通过荧光偏振法(FPIA)检测神经细胞膜流动性；单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测神经细胞DNA损伤程度；激光扫描共聚焦显微术(LSCM)检测神经细胞活性氧(ROS)水平和钙离子(Ca2+)浓度；流式细胞术(FCM)检测神经细胞线粒体通透性转变孔道(PTP)开放情况；酶法检测神经细胞线粒体氧化还原平衡体系GSH/GSSG比率的改变。
(2)干预研究实验分为5组(对照组、Aβ模型、GEN、FA和GEN与FA联合(GEN+FA)干预组)。模型组和各干预组细胞48h培养后经Ap31-35(终浓度为25μM)染毒；各干预组在给予Aβ31-35之前2h给予相应的GEN(27μg/ml)、FA(40μg/ml)和GEN(27μg/ml)+FA(40μg/ml)，染毒后继续培养24h，收集细胞，进行检测，检测方法和指标同毒性实验。
结果:
1.Aβ对大鼠学习记忆的影响与对照组相比，Aβ1-40和Aβ25-35组大鼠平均逃避潜伏期和总路程显著延长(P<0.05)。Aβ1-40组大鼠血清AOC、GSH水平和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)；Aβ25-35组大鼠血清AOC、GSH水平显著降低(P<0.01)，GSH-Px活力显著降低(P<0.05)。
2.SIF联合FA拮抗Aβ对大鼠学习记忆的影响与Aβ1-40模型组相比，SIF干预组大鼠的平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.01)，FA和SIF+FA干预组大鼠的平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)。SIF和SIF+FA干预组大鼠血清AOC和GSH水平显著增高(P<0.01)，FA干预组AOC和GSH水平显著增高(P<0.05)。
3.Aβ对大鼠大脑皮质神经细胞及线粒体的影响与对照组相比，Aβ25-35和Aβ31-35处理组大鼠大脑皮质神经细胞膜流动性显著降低(P<0.01)；神经细胞的拖尾率和尾长显著增高(P<0.01)；神经细胞ROS水平显著升高(P<0.01)；神经细胞Ca2+浓度显著升高(P<0.01)；神经细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，反映线粒体颗粒大小的前向光散射(FSC)和反映线粒体颗粒性状的侧向光散射(SSC)分布峰由低道数向高道数移动，表明线粒体肿胀、颗粒性状发生改变；神经细胞线粒体GSH/GSSG比率显著降低(P<0.01)。
4.GEN联合FA拮抗Aβ对大鼠大脑皮质神经细胞及线粒体的影响与Aβ31-35模型组相比，GEN、FA和GEN+FA干预组大鼠大脑皮质神经细胞膜流动性显著升高(P<0.01)；神经细胞的拖尾率和尾长显著降低(P<0.01)；神经细胞ROS水平显著降低(P<0.01)；神经细胞Ca2+浓度显著降低(P<0.01)；神经细胞线粒体膜电位显著升高(P<0.05)，反映线粒体颗粒大小的前向光散射(FSC)和反映线粒体颗粒性状的侧向光散射(SSC)分布峰由高道数向低道数移动，表明线粒体肿胀、颗粒性状改变的程度减轻；神经细胞线粒体GSH/GSSG比率显著升高(P<0.01)。与GEN干预组相比，GEN+FA干预组神经细胞尾长显著降低(P<0.05)，另外，GEN+FA干预组表示线粒体膜电位的平均荧光强度值(FITC)显著高于GEN干预组(P<0.05)。
结论:
1.Aβ1-40和Aβ25-35是有效的神经毒性物质，可引起大鼠学习能力障碍，可能与Aβ1-40和Aβ25-35介导的神经氧化损伤有关；Aβ25-35和Aβ31-35可引起体外培养的大鼠大脑皮质神经细胞及线粒体损伤，其作用机制之一可能是Ap25-35和Aβ31-35作用于神经细胞，引起神经细胞及线粒体氧化还原状态失衡，导致细胞内ROS和Ca2+增多，进一步损伤神经细胞及线粒体。
2.SIF/GEN单独或联合FA可拮抗Aβ1-40和Aβ31-35的神经毒性，发挥一定神经保护的协同作用，尤其在反映神经细胞DNA损伤程度的彗星细胞彗尾长度和反映神经细胞线粒体PTP开放情况的线粒体膜电位等方面作用更加明显。其作用机制可能为SIF/GEN单独或联合FA可改善机体氧化还原状态，提高抗氧化能力，降低氧化应激水平，从而改善大鼠的学习能力。