目的:多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种浆细胞恶性克隆增生性疾病,属于B细胞分化终末阶段的恶性肿瘤。目前,多发性骨髓瘤在我国的发病率约为1/10万到2/10万,已经超过急性白血病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第2位。近年来治疗多发性骨髓瘤的方法分为干细胞移植、万珂(硼替佐米)联合方案、传统联合用药治疗方案等。但多发性骨髓瘤仍是不可治愈的血液恶性疾病,随着复发次数的增多,治疗越来越困难,表现为更难获得缓解,缓解持续的时间也越来越短。因此寻找更多治疗靶点,具有非常重要的意义。B细胞恶性肿瘤是由于淋巴细胞增殖失控所致,可以发生在B细胞发育的任何时期。B淋巴细胞刺激因子(Blymphocytestimulator,BlyS)是1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)超家族新成员之一,其通过与细胞表面的3个受体:B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和细胞活化因子受体(BAFF-R)而与B淋巴细胞特异结合并诱导其增殖、分化及分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白,在体液免疫反应中发挥着重要作用。Blys是关键的B细胞生长因子,在肿瘤发病过程中起重要作用。我们的前期研究工作显示:BLyS在多发性骨髓瘤患者的外周血中高表达,并随着其病情的好转而逐渐下降,提示BLyS与多发性骨髓瘤发病有关。因此,抑制Blys作用的药物可以作为抗恶性B细胞肿瘤的治疗目标。本研究中,以分泌Blys的MM细胞系KM3为靶细胞,体外和体内实验两方面研究抗BlyS抗体对KM3荷瘤裸鼠移植瘤的生物学效应,为多发性骨髓瘤患者的临床靶向治疗提供理论基础和实验数据。方法: 1体外试验1.1细胞培养和传代人MM细胞系KM3细胞,培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640培养液,在37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养,2～3d传代1次,实验采用对数生长期细胞。1.2 MTT比色实验检测不同浓度抗BlyS抗体对KM3细胞活力的影响体外培养人MM细胞株KM3细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法检测抗BlyS抗体不同浓度组(25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml)、不同时间(24h、48h、72h)对KM3细胞增殖的影响。(上述各组剂量参照Anti-human BLyS Antibody冻干粉说明书确定)。1.3流式细胞术检测不同浓度抗BlyS抗体对KM3细胞细胞凋亡的影响实验组以不同浓度(25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml)抗BlyS抗体处理48h后,应用流式细胞术检测抗BlyS抗体对KM3细胞细胞凋亡的影响。2.体内实验2.1 KM3荷瘤裸鼠模型的建立将处于对数生长期的KM3细胞,用无血清的RPMI1640培养基洗涤2次后,重悬于1:1混匀无血清的RPMI1640培养基和Matrigel中,调整细胞密度为1×108/ml,每只裸鼠右前肢外侧皮下接种0.2m(l细胞数2×107/只),共12只。2.2观察裸鼠成瘤率各组以接种肿瘤细胞后15天为限,裸鼠右前肢外侧可见可测量肿块为标准,成瘤率=成瘤只数/总只数×100%。2.3实验动物分组实验动物随机分为以下3组(每组3只):各组以接种肿瘤细胞后16天开始,各组均按每只裸鼠每次腹腔注射0.2ml配制成不同浓度的抗Blys抗体:a高剂量组:腹腔注射0.2mlBlys抗体稀释液(含抗Blys抗体35μg)。b低剂量组:腹腔注射抗Blys抗体稀释液0.2ml(含抗Blys抗体25μg)。c对照组:腹腔注射PBS溶液0.2ml。每隔2d注射一次,共注射5次。(上述各组剂量参照体外实验确定)。2.4治疗效果观察(1)观察实验动物的一般状况:包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况,并称体重;(2)每隔2d测量肿瘤的长径和短径,根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率(IR):V =ab2/2(a为长径,b为短径),IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积,Vn为治疗组的肿瘤体积);结果:1.体外细胞增殖实验(MTT)结果显示:抗Blys抗体抑制多发性骨髓瘤细胞株KM3增殖,在一定浓度范围内呈时间剂量依赖关系。抗Blys抗体浓度为25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml,24小时的OD值分别为1.36±0.09、0.85±0.03、0.42±0.05;48小时的OD值分别为0.86±0.02、0.69±0.01、0.29±0.01;72小时的OD值分别为0.55±0.02、0.41±0.02、0.21±0.01。对照组24、48、72小时的OD值分别为:2.15±0.16、1.09±0.05、0.70±0.04。结果显示,与对照组相比,随着抗Blys抗体浓度的增加和作用时间的延长,抗Blys抗体抑制多发性骨髓瘤细胞株KM3增殖程度逐渐增高,差异有显著性,有统计学意义(P<0.05)。另将相同浓度的抗Blys抗体组不同时间两两比较,差异有显著性,有统计学意义(P<0.05)。将相同时间不同浓度的抗Blys抗体组两两比较,差异有显著性,有统计学意义(P<0.05)。说明抗Blys抗体能够抑制人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞增殖,且呈剂量-效应和时间-效应依赖性。2.流式细胞术检测结果显示:KM3细胞经抗Blys抗体处理48小时后,流式细胞仪检测显示随着抗体浓度的增加,S期细胞比例逐渐减少。当抗Blys抗体浓度为0μg/ml,25μg/ml,30μg/ml,35μg/ml时,S期细胞所占比例分别为61.70±1.99%,55.23±0.58%,52.83±11.71%,43.93±2.07%。差异有显著性,有统计学意义( P<0.05 )。PI值分别为75.66±1.23%,70.20±1.22%,67.50±1.07%,62.36±2.40%。差异有显著性,有统计学意义(P<0.05)。KM3细胞经抗Blys抗体处理48小时后,流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰,随着抗体浓度的增加,凋亡率逐渐增加。当抗Blys抗体浓度为0μg/ml,25μg/ml,30μg/ml,35μg/ml时,KM3细胞凋亡率分别为3.86±0.04%;8.10±0.11%;8.62±0.08%;9.46±0.13%。差异有显著性,有统计学意义(P<0.05)。说明抗Blys抗体具有促进细胞凋亡作用,且抗Blys抗体浓度越大,促进凋亡作用越明显。3.移植瘤成瘤率:接种平均10(7-15)天后,有9只裸鼠右前肢外侧可见可测量肿块,接种成瘤率75%。4.实验动物的一般状况:a组裸鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量及体重均未发现明显异常变化;b组裸鼠精神情况尚可,活动度较a组略差,饮食饮水量轻度减少;c组在实验后期裸鼠精神萎靡,皮肤暗淡,体重减轻,饮食饮水量明显减少。5.抗Blys抗体对肿瘤的抑制情况:a组随时间的延长肿瘤体积无明显增大甚至有所缩小,b组随时间的延长肿瘤体积稍增大,c组随时间的延长肿瘤体积有明显增大。各组裸鼠经治疗后第4周计算肿瘤生长抑制率,结果, a、b组依次为98.88%、69.31%,各治疗组与对照组之间差异有显著性,有统计学意义(P<0.05), a、b组间比较差异无显著性(P>0.05)。3组裸鼠肿瘤的增生情况及治疗后第4周对肿瘤生长的IR计算结果表明,抗Blys抗体可使多发性骨髓瘤KM3荷瘤裸鼠移植肿瘤缩小。结论:1.在一定浓度范围内,抗Blys抗体抑制人多发性骨髓瘤细胞KM3增殖,且呈时间、浓度依赖性。2.抗Blys抗体促进多发性骨髓瘤细胞KM3的凋亡。3.抗Blys抗体可使多发性骨髓瘤KM3荷瘤裸鼠移植肿瘤缩小。