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茶叶是世界范围内倍受人们欢迎的饮料之一。实验研究及流行病学调查结果显示,茶叶中抗氧化活性成分有助于减少氧化应急引起的人类慢性退行性疾病(如癌症和心血管疾病)发生。茶多酚、茶氨酸、茶碱等为茶叶中主要活性成分,在多酚类化合物中,最重要的是以茶儿茶素为主的黄烷醇类物质,是茶树次生物质代谢的重要成分,其含量约占茶多酚总量的70%-80%。
儿茶素抗氧化功能的实现依赖于其在体内的吸收、分布、代谢转化和排泄过程,了解儿茶素在体内的动态过程有助于阐明其功效成分与健康效应的关系。
本研究模拟中国人的正常饮茶方式,以绿茶为试验材料,观察儿茶素在机体内的动态变化,评价其吸收与利用状况,并且与方便型浓缩茶饮料进行比较,分析两者是否具有生物等效性,进而为科学、合理地评价茶及茶饮料吸收与利用提供依据。
本研究分为两个部分,第一部分建立了茶叶及茶饮料中多组分儿茶素的HPLC分析方法及生物材料中多组分儿茶素的紫外和电化学检测器串联的HPLC方法,为准确测定茶儿茶素含量和开展茶儿茶素的吸收利用研究提供可靠的分析手段。第二部分模拟人的正常饮茶方式,研究了茶叶儿茶素在不同时间段内血浆和尿液中的动态变化,并与方便型茶浓缩饮料进行比较,评价茶水和茶饮料是否具有生物等效性。
在茶叶及茶饮料中多组分儿茶素的HPLC分析方法研究中,经过色谱参数的优化和样品制备方法的选择,建立了儿茶素(8个组分)和咖啡因的多组分HPLC-UV测定方法。以水-乙醇(3:7,v/v)为提取剂,超声提取,采用C18柱分离,以0.1%H3PO4的甲醇溶液为流动相A,0.1%H3PO4的水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为1ml/min,HPLC-UV检测,检测波长为210nm。结果显示,在给定的浓度范围内,各儿茶素组分和咖啡因的峰面积与其相应浓度呈现良好的线性相关,相关系数r>0.999。添加已知儿茶素含量的茶粉回收试验结果表明,各组分儿茶素及咖啡因的平均回收率为61.7%~117.4%,相对标准差(RSD)<10%。本方法分离度好,灵敏度高,具有准确快速的特点,能够准确测定茶叶及其制品中多组分儿茶素含量。
由于儿茶素进入机体后,迅速吸收转化,在机体内广泛分布,使得组织样品中儿茶素的含量处于低水平。为了满足生物样品中低含量儿茶素多组分痕量检测的需要,本研究在茶叶及茶饮料中多组分儿茶素的HPLC分析方法基础上,采用紫外检测器和电化学检测器串联技术,建立了测定血液和尿液中多组分儿茶素含量的HPLC分析方法。血液或尿液样品以β-D-葡萄糖苷酸酶(β-D-Glucuronidase)和硫酸酯酶(sulfatase)酶解后,用乙酸乙酯提取后,血浆样品采用紫外检测器和电化学检测器串联检测,尿液采用电化学检测器检测。色谱条件为:色谱柱为CAPCELLPAKC18MG(5um4.6×150mm)柱,柱温30℃,梯度洗脱,流动相A为0.1%H3PO4的水溶液,流动相B为0.1%H3PO4的甲醇溶液,流速为1ml/min,紫外检测波长为210nm,电化学检测器电位为0.6V。结果显示,在给定范围内,各组分的峰高与其相应浓度呈良好的线性相关,r>0.97。血浆样品的电化学检测器检测平均回收率为73.5-102.3%,相对标准差(RSD)为13.8-27.3%;采用紫外检测器测定低浓度血浆儿茶素含量时回收率低,RSD变异很大,检测高浓度样品时,回收率为73.6-111.3%,RSD为13.4-23.1%。尿液中儿茶素通过电化学检测器测定,平均回收率为63.9-97.1%,RSD为6.5-18.0%。本方法灵敏、可靠,为茶叶及茶饮料中儿茶素的吸收利用研究提供了可靠的手段。
在良好分析技术保证的基础上,本研究开展了茶儿茶素的吸收利用试验。将12名健康受试者随机分成两组,每组男女各半。一组饮用由武夷山绿茶浸泡的茶水样品,另一组饮用由武夷山绿茶经过超声提取、膜浓缩、低温灌装的方便型茶浓缩茶饮料的稀释液。模拟正常的饮茶方式,饮用前,采用本研究第一部分建立的茶及茶饮料中多组分儿茶素的HPLC分析方法测定样品中儿茶素(8个组分)及咖啡因含量。3次累计摄入EGC、EGCG、EC、ECG约400mg,两组摄入EGC、EGCG、EC、ECG水平相当。
分别在0、2、4小时给予茶水或茶饮料,并于饮茶后1、3、5、8、12小时采集静脉血2ml。收集饮茶前12小时内尿液及饮茶后2、4、6、8、12、24小时各时间段尿液,记录每次的尿量。以β-D-葡萄糖醛酸酯酶及硫酸酯酶酶解,采用紫外和电化学检测器串联的HPLC分析方法测定血浆和尿液中总儿茶素(结合态和游离态)的含量及未酶解的血浆和尿液中游离态儿茶素含量,以此分析血液及尿液样品中儿茶素随时间的动态变化。
研究结果显示:茶水组和茶饮料组受试者在第一次给茶后3-5小时血中儿茶素达到峰浓度,至12小时基本恢复到基础水平,并且血浆中以EGC和EGCG为主,EC和ECG次之,GCG和CG的含量较低,此与单剂量摄入儿茶素的文献结果相类似。尿液中各组分排出的浓度在6小时达到峰值,然后逐渐降低,至24小时恢复到基础水平。尿液中以EGC和EC为主,其他组分包括在血浆中浓度较高的EGCG含量均较低。不难看出,没食子酸型儿茶素的排出方式与非没食子酸型儿茶素存在差异,这与多项文献结果相同。由不同时间段的尿量及测得的尿液中儿茶素浓度计算得到的尿液中儿茶素排出量以及按照时间累计的儿茶素累计排出量结果显示,给茶后0小时至8小时各儿茶素组分的排出量变化幅度较大,总儿茶素的排出速率约为0.625mg/h,8-12小时的排出速率为0.25mg/h,而从12-24小时,总儿茶素只缓慢的升高,排出水平仅为0.08mg/h左右,且8小时内尿液中总儿茶素排出量约为5mg左右,24小时内排出量达7mg左右。血浆中游离态儿茶素测定结果显示,血浆中EGCG的游离态含量最高,为50.87μg/L,EGC游离态含量低,其他组分EC、ECG、GCG、CG则几乎未检测游离态形式。
血浆中不同时间的总儿茶素、血浆中儿茶素的血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、尿液中不同时间点的总儿茶素排出浓度及累积排出量、尿液中24小时总儿茶素、EGC及EC的排出分数统计分析结果显示,两组血浆峰值浓度无显著性差异(P>0.05);两组血浆中总儿茶素时间浓度变化曲线的AUC无显著性差异(P>0.05);两组尿液中总儿茶素的峰值浓度无显著性差异(P>0.05);两组在饮茶后2、4、6、8、12、24小时内总儿茶素的尿排出量无显著性差异(P>0.05),表明两组受试者的儿茶素吸收具有生物等效性。